Материалы и методы.

Эксперименты проводили на крысах-самцах Альбино (250±30г):  интактных (n=7), подверженных односторон-нему сдавлению СН (контроль, n=11) и таковых в условиях применения ПТГ (n=7). Сдавливание СН производили в верхней трети бедра (4 мм выше трифуркации) под нембуталовым наркозом (40 мг\кг в/б). ПТГ вводили со следующего дня после сдавления СН в/м ежедневно в течение 7 дней по 0.35 мл (10-9М  раствор). Проводили сравнительный анализ сенсорной (тест рефлекса отведения - ТРО) и моторной (статический седалищный индекс - ССИ) показателей функционального восстановления после сдавления. В электрофизиологическом эксперименте спустя 5, 13, 16, 21, 25, 32, 35, 70 дней в контроле и 1, 3, 5, 7, и 9 дней спустя после иньекции ПТГ под нембуталовой анестезией после фиксации в стереотаксическом аппарате производили кранеотомию, дорсальную ламинэктомию пояснично-крестцового отдела СМ и отсепаровку дистальных флексорного и экстензорного ответвлений сдавленного СН. Затем животных обездвиживали 1% дитиллином (25 мг/кг в/б) и переводили на искусственное дыхание. Стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика 1 µМ, заполненные 2М раствором NaCl, вживляли в передние рога серого вещества поясничных  сегментов  (L4-L5)  в  область  МН СМ  (VIII-IX пластины по Рекседу) для экстраклеточной регистрации их спайковой активности. Высокочастотную стимуляцию (ВЧС) (0,05мс, 0,10-0,16 мА, 50 Гц в течение 1 сек) нервов Gi и Pi (на i – ипсилатеральной стороне по отношению к повреждению) задних конечностей осуществляли биполяр-ными серебряными электродами. Стереотаксически ориентированными по атласу мозга [Paxinos, Watson, 2005] цилиндрическими биполярными электродами осуществляли стимуляцию (параметрами тока 0.05 мс, 0.08 мА, 50 Гц в течение 1 сек) гигантоклеточного красного ядра - RMC и латерального вестибулярного ядра – LVN, т.е. структур центрального контроля для идентификации МН [Minasyan et al., 2009]. Причем, использовалась парная реципрокность эффектов стимуляции или цен-тральных структур, ведающих облегчением флексии и торможением экс-тензии и, наоборот, или - периферических, определенной известной направленности.

Для определения статистической достоверности различий в длитель-ности межспайковых интервалов до и после действия стимула исполь-зовался непараметрический критерий проверки однородности двух неза-висимых выборок - двухвыборочный критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (Wilcoxon-Mann-Whitney test). Так как число регистрируемых спайков было достаточно велико (до нескольких сотен спайков за 10 секундный интервал после действия стимула), использовалась разновидность указанного теста, учитывающая  его асимптотическую нормальность – z-тест. Сравнение критических значений с табличными значениями нормального распределения при уровнях значимости 0.05, 0.01 и 0.001 (для различных испытаний), показывает, что  в результате ВЧС для большинства выборок спайкинга нейрональной активности имеется статистически значимое изменение как минимум с уровнем значимости 0.05.  

Результаты.

Анализ спайковой активности отдельных МН в норме (128 клеток), контроле на 5-70 дни без- (116 клеток, 440 испытаний) и с ПТГ на 1-9 дни (130 клеток, 350 испытаний) выявил формирование ответов на ВЧС нервов Gi и Pi в одном и том же МН, в виде тетанической потенциации (ТП) и депрессии (ТД), с последующими проявлениями посттетанической потенциации (ПТП) и депрессии (ПТД). 

Оn-line регистрация и программный математический анализ импуль-сной активности выявил следующие проявления активности во флексор-ных и экстензорных МН спинного мозга в динамике реабилитации спустя 5-35 дней после сдавления СН в контроле. На ВЧС нерва Gi фактически отсутствует тетаническая потенциация (ТП), превышая в 1.5 раза исходный уровень лишь к 21 дню и спадая в 1.5 раза на 35 день. При ВЧС нерва Рi на 5 день выявляется ТД (порядка 1.4-кратного занижения), сопровождаемая на 13 день ТП (в пределах 1.25-кратного превышения), отсутствием эффекта на 21 день и прогрессивным нарастанием ТП от 25 до 35 дней (с 1.7- до 2.5-кратного). При ВЧС нерва Gi на 21 и 35 дни имела место ранняя ПТП (в пределах 1.5-кратного превышения), а на ВЧС нерва Рi - с 5 до 35 дней (за исключением 21 дня) прогрессивное нарастание ранних и поздних ПТП (от 1.1- до 2.4-кратного) с стационаризацией активности (возвращением к престимульному уровню) к концу испытания, за исключением 25 дня. В целом, после краша СН имело место очевидное восстановление ответов в экстензорных МН при фактическом отсутствии ответов в флексорных МН на ВЧС соответствующих нервов. Иными словами, отмечалось отсутствие регенерации последнего вплоть до 35 и 70 дня испытаний. 

В последующем анализе будут использованы в качестве критических значения эффектов в контроле лишь на 32-35 дни.

На Рис. 1 иллюстрируются усредненные в реальном времени (по 10 сек до и после ВЧС) перистимульные, кумулятивные гистограммы и гистограмма частоты спайкинга активности МН при ВЧС на 1-9 день (Группы А-Д) при применении ПТГ, на 32-35 дни в контроле (Группа Е) и в норме (Группа Ж). Регистрировали ТП+ПТП (А, В) и ТД+ПТП (Б, Г). При стимуляции нерва Gi и протекции ПТГ регистрировали следующие отклонения величин возбудительных постстимульных проявлений (ТП) в динамике развития нейродегенеративных и регенеративных процессов в участке раздавливания по сравнению с нормой (Рис. 1 А): наблюдали снижение в 2.6 , 2 и 1.5 раза в 1-ый, 3-ий и 5-ый дни, соответственно, и приближение к норме на 7 и 9 дни, с некоторым превышением на 7-ой день; в то время как в контроле наблюдалось снижение вдвое вплоть до 32-35 дней испытания. При регистрации тормозных постстимульных проявлений (ТД) на стимуляцию того же нерва Gi имели место следующие значения отклонений от нормы (Рис. 1 Б): уровень снижения ТД определялся в 1.6, 1.3, 1.1 раз больше на 1, 3 и 7 дни, но в 0.6 раз меньше – на 9 день и даже на 32-35 дни в контроле. Иными словами, возбудительные тетанические эффекты нарастали, достигая нормы и выше уже на 7 день испытаний, а тормозные будучи завышенными, также приближались к норме на 7 день, но затем уменьшались к 9 дню, в то время как в контроле на 32-35 дни значения ТП и ТД были заниженными двухкратно и 0.6 раз, соответственно. 

Анализ постстимульных возбудительных тетанических проявлений стимуляции нерва Pi в тех же экспериментальных условиях по сравнению с нормой привел к следующему (Рис. 1 В): наоборот, имел место прогрес-сивный, но скачкообразный спад ТП в пределах 1.9, 1.5, 3, 1.6 и 3.5 раза от 1 до 9 дней, соответственно.

Тормозные постстимульные эффекты на стимуляцию нерва Pi скач-кообразно нарастали, достигая максимума на 9 день, спадая в 1.15 и 0.6 раз в 1-ый и 5 дни и нарастая к 3, 7 и 9 дням в пределах 1.3, 1.1 и 2 раза, соответственно. В целом, при стимуляции нерва Pi к концу испытаний не наблюдалось восстановления ТП до нормы, но сопровождалось нарас-танием ТД до двухкратного превышения над нормой. 

Во всех вышеотмеченных случаях отводили также ПТП, преиму-щественно ранние, сопровождаемые фактической стационаризацией ак-тивности к концу испытания. 

Представленные в Рис. 1 результаты всего массива испытаний в виде усредненных значений возбудительных и тормозных постстимульных проявлений активности в МН СМ при стимуляции нервов Gi и Pi иллюстрируются в последующих Рис. 2 – 7 в виде характерных перистимульных гистограмм суммы спайков и детального анализа на примере произвольно избранных одиночных нейронов: при ВЧС нервов Gi и Pi на 1-9 дни после краша СН (Рис. 4, 5 и 6, 7, соответственно). 

Обсуждение.

С одной стороны, показано, что дистальнее участка повреждения ПН прогрессивно растут миелинизированные моторные аксоны, но оптимальной регенерации мешает изменение их направления [de Ruiter et al., 2008]. Другими авторами, в указанных условиях показано увеличение количества и диаметра больших миелинизированных волокон, достигающего 80% от контрольного уровня [Fugleholm et al., 2000]. В то же время, к 9 мес после секции ПН у зрелых кошек, наряду с длительной реиннервацией, отмечена значительно повышенная пропорция медленных мышечных волокон по сравнению с таковыми - быстрых [Foehring et al., 1986a; b]. Установлено также, что на 14 день после повреждения ПН становится полностью аномальным, несмотря на полный паралич нерва уже через день [Omura et al., 2004]. Как было отмечено выше, для фармакологической протекции нами был избран ПТГ, поскольку относимый к  нему  пептид – PTHrP,  наряду  с  резким  повышением  числа недиффе ренцированных ШК, усиливает их миграцию вдоль аксональной мембраны, содействуя тем самым росту аксонов в экспланте, а следовательно успеш-ной нервной регенерации [Macica et al., 2006]. Учитывая предварительные наши результаты о недостаточности даже 70 дней выдерживания после краша ПН [Минасян и др. 2009; Минасян, 2010], для полного восста-новления раздавливания СН в норме (Рис. 2), в контроле (Рис. 3) и в усло-виях применения ПТГ следует придерживаться мнения о необходимости  более длительных сроков и фармакологической протекции [Stoll, Müller, 1999]. Наконец, было выявлено формирование дистальнее разрушения, при наличии сенсорного притока,  регенерированных аксонов с большей пропорцией проксимальнее разрушения моторных аксонов, иннервиру-ющих экстрафузальные волокна (extensor digitorum longus). Иными слова-ми, была продемонстрирована способность воздействия на межмышеч-ный спраутинг сенсорного синоптического входа к МН [Cuppini et al., 2002].

Рисунок 1.

Усредненные перистимульные (РЕТН Average), кумулятивные (Cumulative Average) и гистограммы частоты (Frequency Average) МН СМ на поврежденной стороне в условиях применения ПТГ, в контроле и норме при ВЧС (50 Гц, 1 сек), нервов Gi (А, Б) и Pi (В, Г) у крыс после краша n. ischiadicus в соотношениях депрессорных и возбудительных постстимульных проявлений. Остальные обозначения в рисунке.

  Рисунок 2.

А, В, Д, Ж – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху), сконструированные на основе пре- и постстимульных возбуждающих – ТП (A, Д) и депрессорных – ТД (В, Ж) проявлений спайковой активности одиночных МН-ов на ВЧС 50 Гц (в течение 1 сек) нервов Gi (А, В) и Pi (Д, Ж) в норме; снизу – диаграммы частоты спайков, с усредненными значениями и детальным анализом (Spike timing, Кумулятивная гистограмма – Cumulative histogram и гистограмма частоты – Frequency histogram) произвольно избранных одиночных нейронов для вышеотмеченных случаев 

ТП (Б, Д) и ТД (Е, З), соответственно.

 Рисунок 3.

А, В, Д, Ж – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху), сконструированные на основе пре- и постстимульных возбуждающих – ТП (A, Д) и депрессорных – ТД (В, Ж) проявлений спайковой активности одиночных МН-ов на ВЧС 50 Гц (в течение 1 сек) нервов Gi (А, В) и Pi (Д, Ж) в контроле на 32-35 дни после сдавления СН; снизу – диаграммы частоты спайков с усредненными значениями и детальным анализом  произвольно избранных одиночных нейронов для вышеотмеченных случаев 

ТП (Б, Д) и ТД (Е, З), соответственно.

Рисунок 4.

А, В, Д, Ж, И – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху), сконструированные на основе пре- и постстимульных возбуждающих (ТП) проявлений спайковой активности одиночных МН-ов на ВЧС 50 Гц (в течение 1 сек) нерва Gi на 1, 3, 5, 7 и 9 дни после раздавливания СН в условиях применения ПТГ; снизу – диаграммы частоты спайков с усредненными значениями и детальным анализом произвольно избранных одиночных нейронов для вышеотмеченных случаев.

Рисунок 5.

А, В, Д – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху), сконструированные на основе растера пре- и постстимульных депрессорных (ТД) проявлений спайковой активности одиночных МН-ов на ВЧС 100 Гц (в течение 1 сек) нерва Gi на 1, 7 и 9 дни после сдавления СН в условиях применения ПТГ; снизу – диаграммы частоты спайков, представленных в растере с усредненными значениями и детальным анализом произвольно избранных одиночных нейронов для вышеотмеченных случаев.

Рисунок 6.

А, В, Д, Ж, И – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху), сконструированные на основе пре- и постстимульных возбуждающих (ТП) проявлений спайковой активности одиночных МН-ов на ВЧС 100 Гц (в течение 1 сек) нерва Pi на 1, 3, 5, 7 и 9 дни после раздавливания СН в условиях применения ПТГ; снизу – диаграммы частоты спайков с усредненными значениями и детальным анализом произвольно избранных одиночных нейронов для вышеотмеченных случаев.

Рисунок 7.

А, В, Д, Ж – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху), сконструированные на основе пре- и постстимульных депрессорных (ТД) проявлений спайковой активности одиночных МН-ов на ВЧС 100 Гц (в течение 1 сек) нерва Gi на 1, 5,  7 и 9 дни после раздавливания СН в условиях применения ПТГ; снизу – диаграммы частоты спайков с усредненными значениями и детальным анализом произвольно избранных одиночных нейронов для вышеотмеченных случаев.

Согласно результаты настоящего электрофизиологического изуче-ния, в целом,. возбудительные тетанические эффекты на ВЧС нерва Gi нарастали и уже на 7 день испытаний, достигали уровня выше нормы, а тормозные – будучи завышенными и, приближаясь к норме на 7 день, к 9 дню уменьшались, в то время как в контроле на 32-35 дни уровни ТП и ТД были заниженными двухкратно и 0.6 раз, соответственно. Во всех случаях отводили также ПТП, преимущественно ранние, с стационаризацией активности к концу испытаний. При стимуляции нерва Pi к концу испытаний не наблюдалось восстановления ТП до нормы, однако имело место нарастание ТД до двухкратного превышения над нормой, что по всей видимости свидетельствует о активации регенерации посредством тормозной протекции. 

Следует отметить значение тормозных тетанических проявлений, в качестве содействующих протекции и лучше выраженных в начальной стадии восстановления поврежденного ПН. Подтверждением служат наши предварительные исследования [Sarkissian et al., 2007; Саркисян и др. 2008; Galoyan et al., 2008; 2010] и литературные данные, свидетельствующие о том, что в некоторых системах в течение развития нервной системы ГАМК действует в качестве фактора, влияющего на пролиферацию, миграцию, дифференциацию и созревание синапса, а также клеточную гибель и экспрессию рецептора ГАМКА [Owens, Kriegstein, 2002]. Согласно недавним данным, предположено далее, что ГАМК и глицин могут играть важную роль в развивающейся и зрелой центральной вестибулярной системе [Tighilet, Lacour, 2001]. Более того, при восстановлении функции после односторонней лабиринтэктомии, известном в качестве вестибулярной компенсации, установлена решающая роль событий, опосредованных ГАМК рецептором в нейронах вестибулярных ядер [Giardino et al., 2002;  Johnston et al., 2001;  Yamanaka et al., 2000].

Литература 

1. Audin M.A., Comlekci S., Ozguner M., Cesur G., Nasir S., Aydin Z.D The influence of continuous exposure to 50 Hz electric field on nerve regeneration in a rat peroneal nerve crush injury model. Bioelectromagnetics.. 2006, 279 (5), p. 401-413. 
2. Bervar M. Effect of weak, interrupted sinusoidal low frequency magnetic field on neural regeneration in rats: functional evaluation. Bioelectromagnetics. Bioelectromagnetics. 2005, 26 (5), p. 351-356. 
3. Cuppini R., Ambrogini P., Sartini S., Bruno C., Lattanzi D., Rocchi M.B. The role of sensory input in motor neuron sprouting control. Somatosens. Mot. Res. 2002, 19 (4), p. 279-285.
4. de Ruiter G.C., Malessy M.J., Alaid A.O., Spinner R.J., Engelstad J.K., Sorenson E.J., Kaufman K.R., Dyck P.J., Windebank A.J. Misdirection of regenerating motor axons after nerve injury and repair in the rat sciatic nerve model. Exp Neurol. 2008, 211 (2), p. 339-350. 
5. Fargo K.N., Alexander T.D., Tanzer L., Poletti A., Jones K.J. Androgen regulates neuritin mRNA levels in an in vivo model of steroid-enhanced peripheral nerve regeneration. J. Neurotrauma. 2008, 25 (5), p. 561-566. 
6. Fleming C.E., Saraiva M.J., Sousa M.M. Transthyretin enhances nerve regeneration. J. Neurochem. 2007, 103 (2), p. 831-839. 
7. Foehring R.C., Sypert G.W., Munson J.B. Post reinnervation maturation of myelinated nerve fibers in the cat tibial nerve: chronic electrophysiological and morphometric studies. J. Neurophysiol.  1986a, 55 (5), p. 931-46.
8. Foehring R.C., Sypert G.W., Munson J.B. Properties of self-reinnervated motor units of medial gastrocnemius of cat. I. Long-term reinnervation. J. Neurophysiol. 1986b, 55 (5), p. 947-965.
9. Fugleholm K., Schmalbruch H., Krarup C. Post reinnervation maturation of myelinated nerve fibers in the cat tibial nerve: chronic electrophysiological and morphometric studies. J. Peripher. Nerv. Syst. 2000, 59 (2), p. 82-95. 
10. Galoyan A.A., Khalaji N., Hambardzumyan L.E, Manukyan L.P., Meliksetyan I.B.,  Chavushyan V.A., Sarkisian V.H., Sarkissian J.S. Protective Effects of Hypothalamic Proline-Rich Peptide and Cobra Venom Naja Naja Oxiana on Dynamics of Vestibular Compensation Following Unilateral Labyrinthectomy. Neurochem. Res. 2010, 35, р. 1747–1760.
11. Galoyan A.A., Sarkissian J.S., Chavushyan V.A., Meliksetyan I.B, Avagyan Z.E., Poghosyan  M.V., Vahradyan H.G., Mkrtchian H.H., Abrahamyan D.O. Neuroprotection by hypothalamic peptide proline-rich peptide-1 in Abeta25-35 model of Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dement. 2008, 4 (5), р. 332-344. 
12. George L.T., Myckatyn T.M., Jensen J.N., Hunter D.A., Mackinnon S.E. Functional recovery and histomorphometric assessment following tibial nerve injury in the mouse. J. Reconstr. Microsurg. 2003, 19 (1), p. 41-48.
13. Giardino L., Zanni M., Fernandez M., Battaglia A., Pignataro O., Calza’ L. Plasticity of GABA(a) system during ageing: focus on vestibular compensation and possible pharmacological intervention. Brain Res., 2002, 929 (1), p. 76-86. 
14. Gupta R., Steward O. Chronic nerve compression induces concurrent apoptosis and proliferation of Schwann cells. J Comp. Neurol. 2003, 461(2), p. 174-186.
15. Johnston A.R., Him A., Dutia M.B. Differential regulation of GABA(a) and GABA(b) receptors during vestibular compensation Neuroreport, 2001, 12, p. 597-600. 
16. Kato N.., Nemoto K., Nakanishi K., Morishita R., Kaneda Y., Uenoyama M., Ikeda T., Fujikawa K., Nonviral HVJ (hemagglutinating virus of Japan) liposome-mediated retrograde gene  transfer of human hepatocyte growth factor into rat nervous system promotes functional and histological recovery of the crushed nerve. Neurosci. Res. 2005, 52 (4), p. 299-310. 
17. Macica C.M., Liang G., Lankford K.L. Induction of parathyroid hormone-related peptide following peripheral nerve injury: role as a modulator of Schwann cell phenotype.  Glia. 2006, 53 (6), p. 637-648.
18. Minasyan A.L., Aznauryan A.V., Chavushyan, Sarkissian J.S. Peculiarities of central and peripheral control of the spinal cord flexor and extensor motor neurons activity. The New Armenian Medical J. 2009, 3 (1), p 44-58. 
19. Mohri T., Tanaka H., Tajima G., Kajino K., Sonoi H., Hosotsubo H., Ogura H., Kuwagata Y., Shimazu T., Sugimoto H. Synergistic effects of recombinant human soluble thrombomodulin and fluid-volume  resuscitation in a rat lethal crush injury model. Shock. 2006, 26 (6), p. 581-586. 
20. Omura T., Sano M., Omura K., Hasegawa T., Doi M., Sawada T., Nagano A. A mild acute compression induces neurapraxia in rat sciatic nerve. Int. J. Neurosci. 2004, 114 (12), p. 1561-1572.
21. Owens D.F., Kriegstein A.R. Is there more to GABA than synaptic inhibition. Nat. Rev. Neuroscience 2002, 3, p. 715-727.
22. Paxinos G., Watson C. // The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Acad. Press, New York, 5th ed. 2005, 367p.
23. Reyesarmijo E. Problems of invalidism in peripheral nerve lesions and their surgical treatment. Rev. Med. Hosp. Gen. (mex). 1964, 27, p. 107-114.
24. Sarkissian J., Chavushyan V., Meliksetyan I., Poghosyan M., Avakyan Z., Voskanyan A., Mkrtchian H., KamenetskyV., Abrahamyan D. Protective effect of Naja naja oxiana cobra venom in rotenone-induced model of Parkinson’s disease: electrophysiological and histochemical analysis. New Armenian Medical Journal. 2007, 1, р. 43-56.
25. Stoll G., Müller H.W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. 1999, 9, p. 313-325.
26. Tighilet B., Lacour M. Gamma amino-butyric acid (GABA) immunoreactivity in the vestibular nuclei of normal and unilateral vestibular neurectomized cats.Eur. J. Neurosci. 2001, 13, p. 2255-2267.
27. Yamanaka T., Him A., Cameron S.A., Dutia M.B. Rapid compensatory changes in GABA receptor efficacy in rat vestibular neurones after unilateral labyrinthectomy.J. Physiol. 2000, 523 (Pt. 2), p. 413-424.
28. Минасян А.Л. Морфогистохимическое изучение динамики развития де- и регенеративных процессов в флексорном и экстензорном ответвлениях седалищного нерва после сдавливания. Матер. Всеросс. конф. с межд. участием «Современные направления исследований функцио-нальной межполушарной асимметрии пластичности мозга» Москва, 2010,  c. 410-414. 
29. Минасян А.Л., Азнаурян А.В., Чавушян Е.А., Саркисян Дж.С. Механизмы развития нейроде- и регенеративных процессов в очаге компрессии нерва под сегментарным и супрасегментарным контролем (Обзор литературы). Вопросы теоретической и клинической медицины. Научно-практический журнал. 2008, 11, c. 54-62.
30. Минасян А.Л., Азнавурян А.В., Чавушян В.А., Саркисян Дж.С. Сравнительное электрофизио-логическое исследование степени восстановления флексорного и экстензорного нервов задней конечности в различные сроки после компрессии седалищного нерва. Матер. межд. научн. конф. «Актуальные проблемы интегративной деятельности и пластичности нервной системы» посвященной 80-летию со дня рождения акад. В.В. Фанарджяна, Ереван, 2009, с.189-195.
31. Саркисян С.Г., Минасян С.М., Меликсетян И.Б., Чавушян В.А., Саркисян Дж.С. Галоян А.А. Протекторный эффект пролином богатого гипоталамического нейрогормона на активность вестибулярных нейронов в условиях односторонней афферентной депривации. Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга», Москва, 2008, с. 635-639.