Апоптоз и субклеточное ремоделирование у больных сахарным диабетом

Ключевые слова: апоптоз, сахарный диабет, инсулиноподобный фактор роста.

Апоптоз, или программированная смерть клеток, описан при многих патологических состояниях, ведущих к миокардиальным дисфункциям, таким как различные формы кардиомиопатии, синдром отторжения после трансплантации сердца, а также состояние затяжной или острой ишемии типа гибернации миокарда [1].   До настоящего времени все еще спорным является вопрос о том, достаточно ли наличие гипоксии для индукции апоптоза или необходимы комбинации с другими повреждающими клетку метаболическими факторами типа ацидоза или аккумуляции клеточных или внеклеточных метаболических сигналов.

Недавно Webster et al. (2001) продемонстрировали, что в модели ацидоза, реоксигенации или реперфузии должны быть сильные стимулы для индукции апоптоза, а не только гипоксия [2]. Имеются также сомнения относительно точного определения начальных стимулов: гипоксия, ацидоз, реоксигенация или реперфузия, окислительный стресс, отсутствие инсулиноподобного фактора роста (IGF-1), химического вещества, соединительнотканый фактор роста (CTGF) и сигнальных путей (bcl-2 и p-53), ведущих к индуцированному апоптозу кардиомиоцитов. Применялось много различных медиаторов, вовлеченных в процесс апоптотической клеточной гибели. Они включают цитокины TNFα, церамид и высокие концентрации метаболического вещества глюкозы [3].

Изучение апоптоза строится на применении преимущественно молекулярно-биологических методов, направленных на выявление продуктов ДНК и РНК–важнейших регуляторов апоптоза, а также экспрессии продуктов генов этих регуляторов.

Значительная часть работ, посвященных анализу механизма гибели кардиомиоцитов и регуляции апоптоза, выполнена на экспериментальном материале.

Большинство работ демонстрируют изменение соотношения ингибиторов (белки семейства bcl, в частности, bcl-2) и активаторов (bax, p-53, fas) апоптоза при преимущественно гипоксическом повреждении миокарда.

В то же время на разном материале и в различных лабораториях получают различные, подчас взаимоисключающие данные. Так, в частности, у собак на экспериментальной модели корреляция экспрессии bcl-2 с интенсивностью апоптоза кардиомиоцитов имела вид обратной зависимости. Выявить экспрессию p-53 на этом материале не удалось (Kolcton I.T., 2001). У собак при реперфузионном повреждении миокарда показаны реципрокные взаимоотношения экспрессии bcl-2 и p-53, при этом экспрессия p-53 выявлялась и в контроле (Zhao Z.Q., 2001). Роль экспрессии p-53 в гипоксической гибели кардиомиоцитов путем апоптоза остается неясной; имеются сторонники как существования этой зависимости, так и ее отсутствия. Кроме того, часть авторов выявляет p-53 в миокарде, другие – нет, в основном в экспериментальных моделях [4].

Работ, выполненных на материале миокарда человека, немного. Биопсии по диабетической кардиомиопатии, по нашему мнению, почти нет.

На аутопсийном материале (Pino F., 2000) во всех исследованных образцах миокарда не удалось выявить экспрессию ни bcl-2, ни np-53.

В то же время I.M. Missao (1996) при исследовании миокарда умерших от инфаркта разных сроков давности не выявил экспрессии bcl-2 в контроле и при старом инфаркте, однако обнаружил отчетливую экспрессию данного маркера у 60% больных, погибших от острого инфаркта в периинфарктной зоне.

Материал и методы. Исследования иммуногистохимического характера проводились при помощи ряда методов, позволяющих выявить экспрессию продуктов в генах bcl-2 и p-53.

Исследования проводили на срезах кусочков миокарда (ушко правого предсердия), фиксированных в 70% этаноле и залитых в парафин по обычной методике. Срезы монтировали на предметные стекла, предварительно обработанные адгезивом (Histagrip, Sigma Co). Срезы депарафинировали в ксилоле и доводили до воды в спиртах нисходящих концентраций. Демаскирование антигенов проводили путем обработки срезов в микроволновой печи двукратно в течение 12 мин (2x6 мин). Эндогенную пероксидазу блокировали инкубацией в 3% растворе перекиси водорода (Н₂О₂) в течение 5 мин, после чего срезы ополаскивали в PBS. Для исключения неспецифического связывания антител срезы инкубировали около 10 минут в блокирующей сыворотке (NHS). Избыток сыворотки удаляли, и на предметные стекла наносили первичные антитела. Инкубацию проводили во влажной камере в течение 30 мин. Затем срезы инкубировали с биотинированными полиспецифическими вторичными антителами 10 мин и с комплексом стрептавидин-пероксидаза в течение 5 мин. Между этапами инкубации срезы ополаскивали в PBS. Использовали первичные и вторичные антитела Novocastra Laboratories Ltd: (bcl-2-клон bcl-2/100/D5, p53-клон DO-7, вторичные антитела и комплекс стрептавидин-пероксидаза – из Novostain Universal Quick Kit). В качестве хромогена использовали диаминобензидин. Ядра докрашивали гематоксилином, срезы обезвоживали, просветляли и заключали в полистирол. Реакцию оценивали по появлению коричневого осадка. В контроле исключался этап инкубации с первыми антителами.

Данные, полученные нами, различались от представленных в литературе.

Особенностью нашего исследования является слабое выявление bcl-2, в пользу чего свидетельствует также окрашивание части ядер; белок bcl-2 локализовался на внутренней митохондриальной мембране и в ядре, хотя в некоторых экспериментальных исследованиях на крысах (Xie Z., 2001) продукт реакции в ядрах был выявлен. В цитоплазме кардиомиоцитов определялась слабая реакция экспрессии bcl-2 без существенной разницы у различных пациентов.

Реакция на p-53 в ядрах кардиомиоцитов была положительная.

Некоторое удивление вызывает тот факт, что у многих больных число окрашенных ядер превышает 50% от общего числа ядер. Впрочем, будем считать это особенностью настоящей серии исследования. С целью оценки соотношения внутриклеточных регуляторов апоптоза иммуногистохимически выявлялась экспрессия продуктов гена bcl-2 и p-53.

Результаты исследования. Целью нашей работы являлось изучение соотношения внутриклеточных регуляторов апоптоза, то есть экспрессии продуктов генов bcl-2, и p-53 иммуногистохимическим методом, сопоставляя с другими клиническими исследованиями у больных СД II типа.

Больные были разделены на 2 группы: I группа состояла из 24 человек (ИБС+СД II типа), II группа – 23 (ИБС+СД II типа+АГ).

Содержание апопротеического белка bcl-2 оценивалось по степеням: сильное, умеренное и слабое окрашивание, а апопротеический белок p-53 оценивался как положительный (+) – 0–24%, (++) – 25–49%, (+++) – 50%.

Определение белка bcl-2. У 8 человек из I группы обнаружено умеренное окрашивание (33,3±3,1), у 16 – слабое (66,7±3,1).

Во II группе у 11 больных обнаружено умеренное окрашивание (47,8±3,2), у 12 – слабое (52,2±3,2) (табл. 1).

Сравнение показателей обеих групп выявило, что у больных II группы превалирует умеренное окрашивание (47,8±3,2 против 33,3±3,1), а в I группе выявлено большое количество больных со слабым окрашиванием (66,7±3,1 против 52,2±3,2).

Таблица 1. Иммуногистохимическое исследование bcl-2, экспрессия bcl-2 (на 100)

У трех человек из I группы обнаружено у 3 – (+), составляющее 12,5±2,6; у 5 – (++); у 16 – (+++)(66,7±3,1).

Во II группе обнаружена следующая закономерность: только у 1 больного (+) – (4,4±2,1); у 2 – (++) (8,7±2,4); у 20 (+++) (86,9±2,6) (табл. 2).

Таблица 2. Иммуногистохимическое исследование белка p-53, экспрессия p-53 (на 100)

Полученные нами данные отличаются от таковых в литературе. Хотя обнаруженное нами окрашивание части ядер белка bcl-2, локализующегося на внутренней митохондриальной мембране, отмечено и в некоторых эксперимантальных исследованиях (на крысах) (Xie. 2001), продукт реакции в ядрах был выявлен. В цитоплазме кардиомиоцитов определялась слабая и умеренная реакция. В общем можно заключить, что имеет место очень слабая экспрессия bcl-2 в кардиомиоцитах, без существенных различий между обеими группами.

Реакция на p-53 отмечена в ядрах кардиомиоцитов, имеется небольшое фоновое окрашивание цитоплазмы, во всяком случае на рис. 1–4 хорошо видно, что интенсивность экспрессии в ядрах различна; имеются больные, у которых количество ядер с (+)-реакцией попадает в различные ранги.

Некоторое удивление вызывает тот факт, что у многих больных число окрашенных ядер превышает 50% от общего числа. Впрочем будем считать это отличительной особенностью настоящей серии исследований.

Обсуждение. Данные, полученные нами, сопоставлять с литературными довольно трудно, в пользу этого говорит также окрашивание части ядер белка bcl-2, который локализуется на внутренней митохондриальной мембране, хотя можно сказать, что это обнаружилось в некоторых экспериментальных исследованиях (на крысах, Xie, 2001). В цитоплазме кардиомиоцитов определялась слабая умеренная реакция. В общем можно полагать, что имеет место очень слабая экспрессия кардиомиоцитов без существенной разницы в II группе пациентов. Таким образом, можно сказать, что на данном материале получена закономерная зависимость между экспрессией bcl-2 и p-53, что при малом количестве p-53 положительных клеток можно было видеть большое количество bcl-2 и наоборот.

Таким образом, апоптоз в кардиомиоцитах у изученных пациентов происходит довольно интенсивно (высокая экспрессия p-53), при этом торможение гибели кардиомиоцитов осуществляется механизмами гипоэкспрессии bcl-2.

Концепция, согласно которой белки семейства bcl могут быть частью апоптотического сигнального каскада, выявляет антиапоптотическое воздействие [3]. Эти белки могут образовать гомо- и гетеродимеры, которые модулируют индукцию апоптоза.

Соотношение антиапоптотического белка bcl-2 и апоптотического белка p-53, по всей вероятности, является решающим в клеточной выживаемости [5]. Активность белка bcl-2 регулируется также на субклеточном уровне (цитозоль или митохондрии), что и обнаружено в наших исследованиях.

Подтвержденное в наших исследованиях уменьшение bcl-2, ведущее к повышению p-53 гомодимеров, приводит к транслокации p-53, к митохондриальной мембране и последующей митохондриальной дисфункции с потерей мембранного потенциала и высвобождением цитохрома-С в цитозоль. Цитохром-С в дальнейшем формирует комплекс с апоптоз-активирующим фактором, активирующим каспазу-9, который включает протеолитический каскад, ведущий к апоптотической клеточной гибели [1–5].

Рис.1. Положительная реакция на p–53 в немногочисленных ядрах кардиомиоцитов

Рис.2. Положительная реакция на p–53 в большей части ядер кардиомиоцитов (I группа)

Рис. 3. Положительная реакция на p–53 в большей части ядер кардиомиоцитов (II группа)

Рис. 4. В цитоплазме кардиомиоцитов слабая реакция на bcl-2

Литература

1. Monkemann H., De Vriese A.S., Blom H.J., et al. Early molecular events in the development of the diabetic cardiomyopathy, Amino Acids, 2002; 23(1-3): 331-336.
2. Schannwel C.M., Schneppenheim M., Perings S., et al. Left ventricular distolic dysfunction as an early manifestation of diabetic cardiomyopathy, Cardiology, 2002, 98 (1-2): 33-39.
3. Codinach Huix P., Freixa Pamias R. Diabetic cardiomyopathy: concept, heart function, and pathogenesis [Spa], An. Med. Interna, 2002; 19(6): 313-320.
4. Cai L., Li W., Wang G., Guo L., Jiang L., Kang Y. J. Hyperglycemia-inducted apoptosis in mouse myocardium: mitochondrial cytochrome C- mediated caspase-3 activation pathway, Diabetes, 2002, 51(6): 1938-1948.
5. Rozanski G.J., Xu Z. Metabolic mechanism of remodeling of cardiac K + cannals Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 2002; 29(1-2): 132-137.

Вопросы, ответы, комментарии