Выявление действия кофеина и аминобактерина на структуру ДНК клеток лимфоцитов человека с применением метода хроматографии

Клюечвые слова: кофеин, однонитевые разрывы ДНК, аминобактерин, репарация ДНК

В окружающей среде, наряду с мутагенами и канцерогенами, присутствует большое число модификаторов, часть которых не способна вызывать мутаций. Однако они могут существенно усиливать мутагенную активность других химических соединений, либо изменять протекание процессов мутагенеза, вызванного факторами физической, химической или биологической природы. Исследование проблемы сочетанного действия различных по механизму воздействия соединений на генетический материал представляет несомненный интерес.

Одним из эффективных модификаторов мутагенеза является кофеин – ингибитор процесса репарации ДНК клетки. Особенно интересны данные о совместном воздействии кофеина с мутагенами различной природы [1,7,8].

Главным событием в процессе индукции цитогенетических повреждений можно считать возникновение однонитевых разрывов ДНК. Известно, что вероятность образования вторичных повреждений генетического материала из первичных повреждений ДНК в результате процессов репликации и репарации зависит от ряда факторов, таких как типы повреждения ДНК, механизмы их восстановления, фаза клеточного цикла и способность клеток к репарации ДНК.

Целью настоящей работы являлось изучение влияния кофеина и (аминобактерина) АМБ (промежуточного продукта синтеза лизина) на уровень однонитевых ДНК и анализ эффективности репарации индуцируемых повреженний. Ранее проводился цитогенетический анализ эффекта кофеина и АМБ на лимфоциты периферической крови человека [1–3,5,6].

Материал и методика. Вещества вводили в разных часах культивирования на 2 часа. Для определения репарации повреждений ДНК клетки после обработки веществами отмывали и дополнительно инкубировали в свежей среде в течение 2 часов.

Для определения однонитевых разрывов ДНК (ОР) методом хроматографии на клетках с (гидроксиапатитом) ГАП клетки метили 3H-тимидином в течение 22 часов. Метка вводилась в концентрации 1,3 –1,5 мкК/мл на 20-м часу инкубации.

Определение возникновения ОР в ДНК проводили методом хроматографии клеточных лизатов на колонках с гидроксиапатитом [4].

Увеличение доли однонитевой фракции ДНК свидетельствует о повреждающем действии химического соединения на ДНК, а восстановление двунитевой ДНК до контрольного уровня при постинкубации клеток в свежей среде свидетельствует о репарации разрывов ДНК.

Результаты и обсуждение. Было показано, что одноразовая обработка лимфоцитов периферической крови человека кофеином на различных часах культивирования не повышала уровень ОР в ДНК клеток (p>0,05). Однако повторная обработка клеток кофеином (за 24 часа до начала культивирования и на 46-м часу культивирования) вызывала достоверное увеличение количества ОР в ДНК (p>0,05) (табл.).

Таблица. Действие кофеина (K) и аминобактерина (АМБ) на ДНК лимфоцитов на разные сроки введения и восстановление повреждений за 2 часа постинкубации (% двунитевой ДНК от суммарной)

Изучение эффектов АМБ на ДНК лимфоцитов показало, что АМБ можно отнести к веществам со слабой ДНК-повреждающей активностью. Так, инкубация культивируемых лимфоцитов с АМБ за 24 часа до начала культивирования не вызывала индукцию ОР (р>0,05), а в варианте с введением АМБ на 46-м часу повышала уровень ОР ДНК (р<0,05). Однако повреждения ДНК, зарегистрированные в последнем случае, репарировались за 2 часа постинкубации в свежей среде. В то же время результаты обработки культур лимфоцитов за 24 часа и потом на 46-м часу культивирования позволяют говорить об адаптации клеток к действию АМБ: наблюдалось уменьшение уровня ОР ДНК. По-видимому, этот эффект можно объяснить тем, что после первой обработки мутагеном активность репарационных систем повышается, что усиливает эффективность их работы.

То обстоятельство, что АМБ проявил себя как слабый мутаген, а для кофеина в ряде исследований установлен сенсибилизирующий эффект, вызывало закономерный интерес к изучению их комбинированного действия. При этом, кофеин вводился в 4 срока: за 24 часа до культивирования, на 28, 46 и 70-м часах культивирования, а АМБ – за 24 часа до культивирования и на 46-м часу культивирования.

Нами показано, что постобработка кофеином лимфоцитов периферической крови, подвергнутых обработке АМБ за 24 часа до начала культивирования, индуцировала усиление ДНК-повреждающего эффекта АМБ, в случае введения кофеина в культуру на 46 и 70-м часах (р<0.05). В то же время не установлен аналогичный эффект при постобработке кофеином на 28-м часу культивирования (р>0,05). Полученные данные о сенсибилизирующем эффекте кофеина согласуются с результатами цитогенетического исследования [2,3,5,6], что свидетельстует о роли однонитевых разрывов в индукции аберрации хромосом при действии слабых мутагенов.

По всей видимости, исходя из наших результатов и данных литературы, можно заключить, что кофеин нарушает правильность или скорость репаративных процессов клетки, что отражается в увеличении кластогенной активности тестируемых веществ.

Литература

1. Арутюнян Р.М., Залинян Г.Г. Цитология и генетика, 1987, т. 21, 2, с. 101-105.
2. Арутюнян Р.М., Залинян Г.Г., Киракосян А.Г. Ж., Агропром: наука и производство, 1992, 11-12¸ с. 20-25.
3. Арутюнян Р.М., Залинян Г.Г., Киракосян А.Г. Ж., Вестник сельскохозяйственных наук, 1993, 1-2, с. 106-111.
4. Арутюнян Р.М., Абрамян Л.Г., Саркисян Засухина Т.Ф., Середин Г.Д., Дурнев А.Д. Биолог. жур. Армении, 1990, 9(43), с. 733-738.
5. Киракосян А.Г., Арутюнян Р.М., Залинян Г.Г. Биолог. журнал Армении, 1997, 3,4, с. 279.
6. Киракосян А.Г., Арутюнян Р.М., Залинян Г.Г. Биолог. журнал Армении, 1998, 3, с. 228.
7. Kihlman B.A., Hansson K., Palitti F., Andersson H.C., Hartley-Asp B. Progress in Mutat. Res., 1982, vol. 4, p. 11-24.
8. Kihlman B.A., Hansson K., Andersson H.C. Mutat. Res., 1982, vol.104, 4-5, p. 323-330.

Вопросы, ответы, комментарии