Методы исследования онкобелка HER-2-neu (обзор литературы)

Основные представления о рецепторе HER-2/neu. Активация и гиперэкспрессия клеточных онкогенов, как известно, играет важ-ную роль в развитии злокачественных опухолей различной этиологии [1]. Одним из важнейших продуктов экспрессии онкогенов является рецептор известный как Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2) [3], который также известен как HER-2/neu или c-erbB-2, т.к. структурно и функционально схож с  с-erbB онкогеном ретровирусной природы [4]. HER-2/neu является частью семейства онкогенов с-erbB, включающего еще три рецептора HER-1, HER-3, HER-4.

Белок HER-2/neu- это трансмембранная рецепторная тирозинкиназа, экспрессирующаяся преимущественно на эпителиальных клетках и кодируемая геном, локализованным в 17q хромосоме. Молекулярная масса рецептора HER-2/neu составляет 185 килодальтон (kDa), поэтому его также иногда называют белком р185.Молекула рецептора состоит из внутреннего тирозинкиназного домена, небольшой трансмембранной части, а также из внеклеточного домена (ВКД), который подобен таковым и у других членов HER- семейства [2,3]. Внеклеточная часть рецептора является высоко гликолизированным белком с молекулярной массой от 97 до 115 kDa и определяется как в среде культивирования некоторых линий клеток РМЖ, так и в плазме или сыворотке  [8] крови здоровых женщин и больных РМЖ. Механизм активации HER-2/neu в настоящее время не совсем понятен, но исследования показали, что рецепторы семейства HER образуют гомо- и гетеродимеры, в результате чего активируются внутренние тирозинкиназы и весь последующий каскад событий регулируемого ими сигнального пути [6]. Лиганд к рецептору HER-2/neu до настоящего времени не обнаружен. Родственные рецепторы активируются многочисленными лигандами, среди которых собственно эпидермальный фактор роста (ЭФР), а-трансформирующий фактор роста, амфирегулин и др., активирующие рецептор 1 типа  HER-1, а также, открытое относительно недавно, семейство пептидных лигандов, названных неурегулины, имеющие молекулярную массу около 45kDa и взаимодействующие преимущественно с рецепторами HER-3 и HER-4. 

Методы определения HER-2/neu. Методы оценки экспрессии HER-2/neu в ткани основаны на двух подходах: определение изменений на белковом (по гиперэкспрессии белка на мембране клетки) или на геномном уровне (по амплификации гена HER-2/neu). 

Наиболее широко используемый метод определения гиперэкспрессии белка HER-2/neu является иммуногистохимический (ИГХ) [11] , для определения числа копий или амплификации гена HER-2/neu исполь-зуется метод флюоресцентной гибридизации in situ (Fluorescent In Situ Hybridization -FISH). Иммуноферментный анализ используется с 1991 года и позволяет проводить количественный анализ как в ткани опухоли, так и в сыворотке крови.

Американское управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов FDA (Food and Drug Administration)   одобрило два вида антител для иммуногистохимического выявления больных, являющихся кандидатами для терапии герцептином. Они включают Herceptest (DAKO Cytomation, Copenhagen, Denmark) и Pathway (Ventana, Medical Systems, Tucson, AZ). Стандартизированная система подсчета и интерпретации результатов иммуногистохимического анализа была разработана с помощью стандартных клеточных линий. В данной системе клетки, содержащие менее 20000 рецепторов, не покажут ника-кого окрашивания (0). Клетки, содержащие приблизительно 100000 рецепторов, показали бы частичное окрашивание мембраны - менее, чем у 10 % клеток (1+). В клетках, содержащих около 500000 рецепторов, пол-ное окрашивание будет наблюдаться в более чем 10% клеток (2+). Полное и сильное окрашивание мембраны больше чем у 10% клеток, показали бы клетки, содержащие приблизительно 2300000 рецепторов (3+) [5].

Вторая методика, используемая для определения HER-2/neu статуса - это FISH-анализ (флуоресцентная in situ гибридизация). Преимущества данной методики заключается в возможности определить амплификацию или количество копий гена, кодирующего рецептор HER-2/neu. Техника FISH-анализа очень надежна, обеспечивая чувствительность 95,5% и 100% специфичность для обнаружения амплификации гена HER-2/neu. В настоящее время применяются два коммерческих набора для FISH анализа, разрешенные к применению FDA: PathVysion (Vysis, Downers Grove, IL), рекомендованный для пациенток с региональными метаста-зами, подлежащих адъювантной терапии антрациклин-содержащими схемами, а также для выявления группы больных, у которых возможна терапия герцептином, и Inform Test (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), используемый в качестве прогностического фактора у пациенток с раком молочной железы  (РМЖ) без региональных метастазов [7].

Иммуногистохимический метод достаточно прост в выполнении и может применяться в условиях большинства патологоанатомических лабораторий, FISH-метод более дорогостоящий и трудоемкий, требующий специального оборудования. Поэтому, как правило, второй метод используется для подтверждения или уточнения результатов, полученных с использованием иммуногистохимического анализа  [10].

Позже была предложена новая методика CISH (chromogenic in situ hybridization), как альтернатива FISH-методу. Данная методика основана, в отличие от флюоресцирующей техники, на пероксидазной реакции, ко-торая может визуализироваться с помощью обычного микроскопа и устра-няет потребность во флуоресцентном оборудовании. Хотя технические преимущества CISH по сравнению с FISH методом были продемон-стрированы, однако, в настоящее время FDA не рекомендует исполь-зовать данную методику в клинической практике. Необходимо продол-жать исследования, чтобы с полной уверенностью утверждать адек-ватность двух методов. Сравнение иммуногистохимического и FISH методов показало значительную степень соответствия результатов. Множество сообщений говорит о более чем 90% совпадений ИГХ и FISH результатов при гиперэкспрессии HER-2/neu (3+), в некоторых случаях достигая 100%  [7]. 

Третий метод, используемый для определения статуса HER-2/neu - это иммуноферментный метод. Определение сывороточного HER-2/neu про-водится иммуноферментным методом с использованием стандартного набора реактивов HER-2/neu компании Oncogene Science/Bayer HealthCare LLC (США).

Он может использоваться для количественного определения всего белка р185 в опухоли или его циркулирующего растворимого фрагмента в плазме или сыворотке крови. Zabrecky и др. [9], используя монокло-нальные антитела, направленные на ВКД HER-2/neu, продемонстрирова-ли, что фрагмент рецептора HER-2/neu мигрировал во внеклеточную среду. В последние несколько лет описано множество иммуноферментных методик, используемых для определения ВКД в плазме и сыворотке больных РМЖ и контрольных группах здоровых женщин. Однако отсутствие стандартизации этих методов затрудняет сравнение результатов, полученных разными авторами. 

В целом, ИГХ и FISH методы - это единственные тесты, рекомен-дованные FDA для выявления групп больных метастатическим РМЖ, подлежащих терапии герцептином [7]. В настоящее время ИГХ и FISH методы используются в комплексе, что позволяет более точно отбирать группы пациенток для таргетной терапии.

Литература

1. Aaronson SA. Growth factors and cancer. Science 1991; 254:1146- 1153.
2. Bargmann CI, Hung MC, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor related protein. Nature 1986; 319:226- 230.
3. Brandt-Rauf PW, Pincus MR, Carney WP. The c-erbB-2 protein in oncogenesis: molecular structure to molecular epidemiology. Crit Rev Oncog. 1994;5(2-3):313-29.
4. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230:1132-1139.
5. Hayes DF, Thor AD. c-erbB-2 in breast cancer: development of a clinically useful marker. Semin Oncol 2002; 29:231-245.
6. Kurebayshi J. Biological and clinical significance of HER2 overexpression in breast cancer. Breast Cancer 2001;8:45-51.
7. Mass RD, Proc Am Soc Clin Oncol, abstract 19, 2000
8. Pupa SM, Menard S, Morelli D, Pozzi B, De Palo G, Colnaghi MI. The extracellular domainof the c-erbB-2 oncoprotein is released from tumor cells by proteolytic cleavage. Oncogene 1993; 8:2917-2923.
9. Ross JS, Fletcher JA. BER-2/neu (c-erbB2) gene and protein in breastcancer. Am J Clin Pathol 1999; 112:S53-S67.
10. Schaller G, Evers K, Papadopoulos S, Ebert A, Buhler H. Current use of HER2 tests. Ann Oncol 2001;12:S97-S 100.
11. Zabrecky JR, Lam T, McKenzie SJ, Carney W. The extracellular domain of pi 85 is released from the surface of human breast carcinoma cells, SK-BR-3. J Biol Chem 1991; 266:1716-1720.

Вопросы, ответы, комментарии