Изменения цитометрических показателей ядра и ядрышек при алюминиевом токсикозе в клеточных культурах человека

Ключевые слова: ядро, ядрышко, хлорид  алюминия

Алюминий является не только важным клеточным токсином, но и одним из наиболее значительных этиологических факторов нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера [13]. Несмотря на весьма широкое распространение в природе и медико-биологическое значение, механизм алюминиевого патогенеза остается не до конца раскрытым. цитопатогенез алюминия является одной из наиболее важных и наименее изученных проблем современной токсикологии [15]. В основной массе работ, изучающих тему клеточных патологий, вызываемых ионами алюминия, указывается на вакуолизацию цитоплазмы, некоторые изменения структуры клетки. В середине 80-х годов ХХ века была показана вовлеченность ядерных структур в алюминиевый патогенез [11, 12]. Почти одновременно с этим, в работе Wen & Wisniewski [14], указывалось на связь алюминия с  рибосомальной РНК (рРНК) при нейродегенеративных процессах в условиях in vivo. Как известно, синтез рРНК происходит в ядрышках. В связи с вышеуказанным нами была поставлена цель – изучить цитометрические аспекты алюминиевого токсикоза в ядерных структурах клеток культур человека различного происхождения.

Материал и методы

В  работе использован ряд перевивных клеточных культур человека различного филогенетического происхождения:

1. SHSY5Y – перевивная линия нейробластомы человека. Клетки культивировались в среде, состоящей из смеси сред Eagle DMEM и F₁₂ в соотношении 1:1 с добавлением  10% бычьей сыворотки. Посевная доза 2 х 10⁵ клеток/мл. Монослой получали через 48 часов после начала пассирования. 
2. HEK – перевивная линия эмбриональных клеток почки человека. Клетки культивировались в среде Eagle DMEM с добавлением 15% бычьей сыворотки. Посевная доза 1 х 10⁵ клеток/мл. Монослой получали через 48 часов после начала пассирования.
3. HEp-2  – трансформированная перевивная линия карциномы гортани человека. Клетки культивировались в среде Eagle MEM с добавлением 10% бычьей сыворотки. Посевная доза 1 х 10⁵ клеток/мл. Монослой получали через 48 часов после начала пассирования. 
4. D – трансформированная перевивная линия рабдомиосаркомы человека. Клетки культивировались в среде Eagle MEM с добавлением 10% бычьей сыворотки. Посевная доза 1 х 10⁵ клеток/мл. Монослой получали через 48 часов после начала пассирования. 

Клетки SHSY5Y и HEK  предоставлены Dr Pascale Galea (Trophos-Марсель), а HEp-2 и RD –  Институтом полиомиелита, Москва.

Для цитометрических и цитологических исследований весь материал фиксировали в 960 этиловом спирте в течение 30 мин, а затем одновременно окрашивали основным фуксином по Фельгену. Гидролиз ДНК проводили в 5N HCl в течение 1 часа при t = 22⁰С (в термостате) и красили реактивом Шиффа по Стоуэлу [3].

Количественное определение площади и периметра каждого из ядрышек в отдельности (для определения тотального ядрышка в многоядрышковых клетках суммировали полученные значения) производили на сканирующем микроскопе-фотометре, оснащенном компьютером и видеокамерой телевизионным методом на максимуме поглощения комплекса ДНК-фуксин (длина волны 575 нм). Измерения, выраженные в условных единицах, в каждом случае производили в 100 ядрах.

Токсическое действие AlCl₃  на исследуемые клетки перевивных культур изучали по степени деструкции монослоя и на популяционном уровне [1].

Для исследований применялось максимальное разведение хлорида алюминия, не вызывающее цитодеструктивного действия, при 48-часовой экспозиции, в изучаемых клетках –1‰ AlCl₃ [1].

Результаты и обсуждение

Как известно, токсическое действие ионов алюминия не ограничивается клетками нейронального происхождения [6] и в различных клетках возможны различные механизмы токсического действия ионов алюминия [7]. Для оценки динамики изменений ядерных цитометрических показателей изучалось 48-часовое воздействие хлорида алюминия на все клеточные линии. Основные изученные цитометрические параметры приведены в табл. 1.

Таблица 1

Изменение ядерных показателей под действием алюминиевого токсикоза

* достоверно по сравнению с контролем, p‹0,001

** достоверно по сравнению с контролем, p‹0,05

Как следует из табл. 1, площадь и периметр ядер достоверно снижаются во всех клеточных линиях, за исключением RD.

Нами были изучены изменения количества ядрышек и их абсолютных размеров во всех исследуемых группах. Данные по этим показателям приведены в табл. 2.

Как следует из табл. 1, в клеточных культурах SHSY5Y, HEК 293 хлорид алюминия вызывал достоверное уменьшение площади ядрышек, в культуре RD под его воздействием показана тенденция к уменьшению этого показателя. Также в клетках HEК 293 показано достоверное снижение среднего числа ядрышек на ядро. 

Таким образом, нами продемонстрировано угнетение ядрышкового аппарата под воздействием хлорида алюминия. 

В табл. 2 приведены данные по динамике основных ядрышковых показателей при воздействии ионов алюминия.

Таблица 2

Изменение основных ядрышковых показателей под действием алюминиевого токсикоза

* достоверно по сравнению с контролем, p‹0,001

** достоверно по сравнению с контролем, p‹0,01

*** достоверно по сравнению с контролем, p‹0,05

**** тенденция 

Как видно из табл. 2, ядрышковый аппарат существенно угнетается под воздействием хлорида алюминия во всех культурах, кроме НЕр-2.

С учетом некоторой противоречивости данных по ядру и ядрышкам, а также принимая во внимание данные литературы, было решено вычислить относительные соотношения изученных показателей. 

Данные по ядрышково-ядерным соотношениям и их изменению при воздействии ионов алюминия приведены на рисунке.

 Рисунок. Доля площади ядрышка в площади ядра

Как следует из рисунка, за исключением культуры НЕр-2, реакция клеток является сходной – происходит снижение доли ядрышкового компонента в общей площади ядра. Эти исследования в целом совпадают с нашими более ранними данными [1] об устойчивости клеток линии НЕр-2 к токсическому воздействию ионов алюминия и говорят о том, что ядрышковые цитометрические показатели при алюминиевом токсикозе более адекватно характеризуют степень патологического состояния клеточной популяции.

Полученные результаты свидетельствуют об уменьшении площади ядер и ядрышек в клеточных культурах. Так как площадь ядрышек напрямую свидетельствует о функциональном состоянии клетки в целом и трансляционной активности в частности [5, 10], можно сделать вывод о токсическом воздействии хлорида алюминия на клеточные линии. Однако нами впервые показано, что угнетение площади ядрышка, в чувствительных к воздействию ионов алюминия клетках, наблюдается как в абсолютных, так и относительных показателях по отношению к площади ядра. Следовательно, ядрышковые показатели при алюминиевом токсикозе являются более достоверным показателем цитотоксического действия, нежели ядерные индексы. Возможное объяснение этого явления – селективный отбор токсическим фактором более устойчивых клеток с низкой трансляционной активностью. Но этот механизм не может быть основным механизмом описанных выше эффектов. Так, согласно данным [2], в клеточных культурах, как и в условиях in vivo, число ядрышек в ядре генетически детерминировано, и, следова тельно, при селективном отборе следует скорее ожидать изменения среднего числа ядрышек на ядро, что не наблюдается в полученных результатах. 

Объясняется этот феномен скорее всего изменениями клеточного цикла. Известно, что объемы ядрышек в G2 фазе оказываются примерно в 2 раза больше, чем в G1 фазе [9], и, поскольку ранее нами показано значительное снижение пролиферативной активности клеток и подавление митотического индекса в различных популяциях под действием хлорида алюминия [1], блокирование клеток в фазе G1 приведет к угнетению цитометрических показателей ядрышек. С учетом данных [4, 8] о взаимосвязи между площадью ядрышковообразующих регионов и скоростью клеточного цикла, а также данных о подавлении митотического индекса в чувствительных клеточных культурах под воздействием ионов алюминия можно сделать вывод об ингибирующем влиянии ионов алюминия на основные метаболические процессы в клетке в целом. 

В то же время молекулярные механизмы подобного действия алюминия не совсем понятны. Согласно данным Quintana et al. [11], в ядрышках значительного числа типов клеток содержится определенное количество алюминия без развития какой-либо патологии. В работе Wen & Wisniewski [14], проведенной в условиях in vivo, было сделано предположение, что причиной нейротоксического воздействия алюминия может являться связь ионов алюминия с рРНК. 

Литература

1. Каралян Н. Ю. Сравнительный анализ токсического действия алюминия на культуры клеток человека. Мед. наука Армении НАН РА, 2006, т. XLVI,1, с.111-113.
2. Кучерявая Н. А., Завольная Е. С., Вахтин Ю. Б. Изменчивость числа ядрышек в потомствах интактных и УФ-облученных клоногенных клеток HeLa и наследуемость этого признака. Цитология и генетика, 1981, т.15, 5, с.3-7.
3. Магакян Ю А., Каралова Е. М. Цитофотометрия ДНК. Ереван, 1989.
4. Canet V., Montmasson M.P., Usson Y., Giroud F., Brugal G. Correlation between silver-stained nucleolar organizer region area and cell cycle time, Cytometry, 2001 Feb 1;43(2):110-6.
5. Derenzini M., Trere D., Pession A., Govoni M., Sirri V., Chieco P. Nucleolar size indicates rapidity of cell proliferation in cancer tissues, J. Pathol., 2000 Jun; 191 (2) 181-6.
6. Dominguez M.C., Sole E., Goni C., Ballabriga A. Effect of aluminum and lead salts on lipid peroxidation and cell survival in human skin fibroblasts, Biol. Trace Elem. Res., 1995 Jan-Mar;47(1-3):57-67.
7. Exley C., Birchall J.D. The cellular toxicity of aluminium, J., Theor. Biol., 1992 Nov 7;159(1):83-98.
8. Horky M., Kotala V., Anton M., Wesierska-Gadek J. Nucleolus and apoptosis, Ann. N. Y. Acad.  Sci., 2002,  Nov; 973:258-64.
9. Lepoint A., Goessens G. Quantitative analysis of Erlich tumor cell nucleoli during interphase, Exp. Cell. Res., 1982, 121, p.120-128.
10. Plate K.H., Ruschoff J., Mennel H.D. Nucleolar organizer regions in meningiomas. Correlation with histopathologic malignancy grading, DNA cytometry and clinical outcome, Anal. Quant. Cytol. Histol., 1990, Dec;12(6):429-38
11. Quintana C., Olmedilla A., Antoine N., Ollacarizqueta A. The occurrence of metals Al, Fe, Ni, Cu, Zn in the nuclei of animal cells: an ultrastructural, in situ, X-ray microanalytical study, Biol. Cell, 1987;61(3):115-9.
12. Truchet M., Jeantet A. Y, Petter C. Cell nucleus intervention in aluminium concentration by the rat liver cells. Experimental study, C R Acad Sci III, 1987;305(7):259-63.
13. Walton J. R. Aluminum in hippocampal neurons from humans with Alzheimer’s disease, Neurotoxicology, 2006, May;27(3):385-94.
14. Wen G. Y., Wisniewski H. M. Histochemical localization of aluminum in the rabbit CNS, Acta Neuropathol. (Berl), 1985;68(3):175-84.
15. Zatta P., Lain E. and Cagnolini C. Effects of aluminum on activity of Krebs cycle enzymes and glutamate dehydrogenase in rat brain homogenate, Eur. J. Biochem., 2000, 267, p.3049-3055.

Вопросы, ответы, комментарии