Факторы оксидативного повреждения крови больных эссенциальной гипертонией

Ключевые слова: эссенциальная гипертония, кровь, оксидативное повреждение

Допускается, что в молекулярно-биохими­ческие механизмы патогенеза эссенциальной гипертонии (ЭГ) вовлечены процессы, сопровож­даемые развитием оксидативного стресса. Однако при ЭГ систематические исследования, изучаю­щие роль и механизмы оксидативного повреждения экстрацеллюлярных и внутрицеллюлярных анти- и прооксидантных систем, изучены недостаточно. Установлено, что у больных ЭГ первой степени (артериальное давление в диапазоне от 140/90 до 160/100 мм рт.ст.) наблюдается снижение уровня тиоловых групп в плазме и нет корреляции с показателями уровня артериального давления (АД), а активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы не изменяется. Однако у больных ЭГ второй и третьей степени (уровни АД от 160/100 до 180/110 и >180/>110 мм рт.ст. соответственно) наблюдается снижение активности этих ключевых ферментов антиоксидантной активности, на фоне повышения активности глутатионпероксидазы (ГПО). Изменения активности СОД, каталазы и ГПО в плазме больных ЭГ всех степеней связы­ваются с различием интенсивности оксидативного повреждения активными формами кислорода (АФК) [21]. При этом в результате реагирования АФК с липидными компонентами биомембран (включая и эритроцитарные мембраны) образуют­ся гидроперекиси. Этот деструктивный процесс известен как перекисное окисление липидов (ПОЛ). Далее эти гидроперекиси превращаются в малоновый диальдегид (МДА), который является одним из продуктов ПОЛ и индикатором окси­дативного повреждения клеток и тканей, причем эндогенные антиоксидантные системы противо­действуют этому процессу и снижают уровень оксидативного повреждения. АФК вовлечены и в процесс нарушения функции эндотелиальных клеток сосудов.

Различные антигипертензивные лекарства помимо гипотензивного действия обладают также антиоксидантными свойстами. До прохождения лечения ЭГ антигипертензивными лекарствами уровень МДА в сыворотке крови повышается, а активность СОД снижается. Так, до прохождения курса лечения ЭГ антигипертензивными лекарст­вами уровень МДА в сыворотке крови бывает высоким, а активность СОД низкая, однако после трехмесячного курса лечения наблюдается су­щест­венное регулирование уровня этих биохими­ческих показателей, на основании чего сделано заключение о том, что ЭГ ассоциируется повыше­нием оксидативного стресса и снижением антиокси­дантного статуса [22]. В этих условиях положи­тель­ный антистрессорный эффект оказывает пре­парат ацебулол (селективный бета1-адренобло­катор) путем регулирования антиоксидантного статуса в эритроцитах [18]. После шестимесячной терапии больных ЭГ антагонистом кальция – бинидипином наблюдается снижение повышенного уровня АФК продуцируемыми НАДРН-зависи­мыми оксидазами, локализованными в лейкоцитах. Выявлена корреляция между уровнями АФК систолическим артериальным давлением (САД) и диастолическим артериальными давлением (ДАД) при лечении этим лекарством [23]. Антиги­пертензивная терапия антагонистом ангиотензина АII кандезартоном и антагонистом кальция амлодипином также снижает уровень клеточного оксидативного повреждения [20]. При атероскле­розе и ЭГ наблюдается стимулирование процесса оксидативного повреждения эритроцитарных мембран (ЭМ), что вызывает повышение уровня холестерина в сыворотке крови, степени гемолиза, снижение уровня глутатиона и текучесть ЭМ, особенно при ожирении. В результате этого сни­жается тканевая оксигенация [11]. При ЭГ наблю­дается также окисление и инактивирование нитроксильного радикала, что вызывает наруше­ние функции сосудов и изменение АД. При этом терапия ингибитором ангиотензин-превращающего фермента эналаприлом и ингибитором ангиотен­зина АII лозартаном помимо снижения САД и ДАД существенно снижает уровень МДА в плазме, глутатиона и нитроксила. Этим обусловлен антиоксидантный эффект этих лекарств [13]. Уровень перекиси водорода в плазме крови боль­ных ЭГ также резко повышается. В результате увеличивается и стационарная концентрация высокоактивных гидроксильных радикалов (НО.), которые оказывают деструктивное действие почти на все биосистемы, включая регуляторные системы функционирующего эндотелия сосудов [19]. При этом наблюдается протективный эффект при лечении антагонистами кальция дигидропири­динового ряда [12]. 

Роль и состояние супероксид-продуцирующих оксидаз при атеросклерозе и ЭГ, их регуляция на клеточном уровне при оксидативном повреждении этих клеток еще полностью не установлены, однако было показано, что экспрессия и регуляция этих оксидаз осуществляется соответствующими цито­кинами [17]. При этом НАДРН-зависимые окси­дазы участвуют в процессе продуцирования суперок­сидов и в нефагоцитирующих клетках [16], а человеческие эндотелиальные клетки в культуре клеток экспрессируют мРНК и белок для цитозоль­ного компонента фагоцитирующих супероксид-продуцирующих оксидаз [14].

С разработкой комплексного способа одновре­менного количественного и качественного опреде­ле­ния как известных металлопротеинов антиокси­дантной активности (МАА), так и новых типов металлопротеинов прооксидантной активности (МПА) крови и с выявлением их биологической роли [8,9], становится актуальным определение уровня и активности этих металлопротеинов (МП) в крови больных ЭГ для оценки молекулярно-биохимических механизмов патогенеза ЭГ как результата нарушения анти- и прооксидантного статуса крови.

Целью настоящей работы явилось определение характерных изменений уровня и активности МАА и МПА в крови больных ЭГ с неконтролируемым АД (уровень АД›140/90 мм рт. ст.)

Материал и методы

Была обследована кровь больных ЭГ с неконт­ро­лируемым АД (14 мужчин и женщин в возрасте 38–69 лет с давностью заболевания 2–4 года). В качестве контроля была использована донорская кровь лиц с нормальным АД.

МАА (Сu-, Zn-СОД, каталаза, полученные из растворимой фракции эритроцитов, церулоплазмин (ЦП) и трансферрин (ТФ) – из сыворотки крови) и МПА (нейтральные изоформы цитохрома b558: цит b558III, b’558III, b558IV, b558’IV и цит b558 – из эритроцитарных мембран, супероксид-продуци­рую­щий липопротеин сыворотки – супрол и цитохром b5 – из растворимой фракции эритро­цитов) получали из крови больных ЭГ и донорской крови биотехнологическим способом, избегая использования детергента для солюбилизации белков из ЭМ [5,6].

При этом пробы очищенных ЭМ (по 5мл, смешанные с 0,04 М калий фосфатным буфером, рН 7,4) отделяли для определения О₂^- - продуци­рующей и метгемоглобин (метНb)-восстанавли­вающей активности цит b558III [9] в гетерогенной фазе. Количество полученных МП определяли из­ме­рением плотности максимального оптического поглощения, характерного для цит b5 при 525 нм, для изоформ цит b 558 сыворотки и ЭМ – 530, супрола – 430, ЦП – 610 и ТФ – 470 нм (голо­форма).

Супероксиддисмутазную активность фермента и О₂^- - продуцирующую активность супрола и цит b558III [8] определяли нитротетразолиевым синим (НТС), путем вычисления процента подавления (в случае СОД) или стимулирования (в случае супрола и цит b558III) образования формазана (при 560 нм). За единицу активности СОД принимали то количество фермента, которое вызывает 50% ингибирование образования формазана при восстановлении НТС супероксидными радикалами. За единицу О2- - продуцирующей активности супрола или цит b558III принимали количество белка, способного стимулировать образование фор­ма­зана на 50%. Каталазную активность фермента определяли перманганатометрическим методом, рассчитав количество белка, расщепляющего 0,1М перекиси водорода за 1 мин при 20о C. МетНb-восстанавливающую активность цит b558III определяли in vitro, используя свежеполученный метНb (ферриНb) крови человека. При этом величина оптического поглощения альфа-полосы (при 565 нм) метНb составляла 0,9, а величина поглощения бета-полосы используемого цит b558III (при 530 нм) в реакционной смеси составляла 0,04. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра к 2,5 мл раствора метНb добавляли 0,2 мл цит b558III или 0,2 мл ЭМ, смешанных с 0,04 М калий-фосфатным буфером (КФБ), рН 7,4. После быстрого перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в покое в аэробных условиях in vitro в течение 10–15 ч при 30оC. Затем после быстрого смешивания реак­ционной смеси была определена кинетика восста­новления метНb до ферроНb путем измерения снижения интенсивности плотности альфа-поглощения метНb уже в течение 1,5–2 ч при 30оC. Это снижение прямо пропорционально образовав­шемуся ферроНb, который имеет максимальное оптическое поглощение при 555 нм. Для опре­де­ления степени рилизинга (самоотщепления) из ЭМ последние были инкубированы с 0,04 М КФБ в течение 5 дней при 4оC и уровень отщепленной суммар­ной фракции изоформ цит b558 ЭМ опре­деляли в супернатанте после соответственной ионооб­менной хроматографии [10].

Оптические спектральные измерения осуществ­ляли на спектрофотометре «Specord UV-VIS» (Гер­мания) с длиной оптического пути 1 см. Статисти­ческую обработку полученных результатов осу­ществ­ляли методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности (Р).

Результаты и обсуждение

Сразу же после поступления в клинику больных ЭГ в крови их наблюдалось значительное повы­шение уровня цит b5–переносчика электрона для НАДРН-зависимой метНb-редуктазы в цитозоле эритроцитов (табл.1). Это свидетельствует о

Таблиц 1 Относительное изменение (%) уровня активности МПА и МАА крови больных ЭГ с неконтролируемым АД по сравнению с 100% контрольными показателями донорской крови, p‹0,05,n=8

наличии сердечно-сосудистого фактора риска – гиподинамии у больных ЭГ [2]. При этом увели­чивались уровни МПА в ЭМ, и в частности ключевой изоформы цит b558 ЭМ – цит b558III, с увеличением его НАДРН-зависимой супероксид-продуцирующей и метНb-восстанавливающей активности в гомогенной и особенно в гетерогенной фазе (в ЭМ). Увеличивались и уровни других изо­форм цит b558 ЭМ. Это свидетельствует о сущест­венном изменении гемопротеинового состава ЭМ [4], как результат оксидативного повреж­дения этих мембран АФК. При этом стабильность ЭМ существенно снижалась в результате повышения степени рилизинга цит b558 из ЭМ [10], проник­новения Нb в ЭМ и вхождения в нестабильное комплексное соединение с цит b558. Из-за повыше­ния супероксид-продуцирующей активности цит b558III увеличивалась стацио­нарная концентрация супероксидных радикалов, что, с одной стороны, является положительным явле­нием для стимули­рования метаболических процессов с их участием в ЭМ, с другой – продуцированные супероксиды могут пагубно влиять на состояние окружающих биосистем и в первую очередь на фосфолипидные остатки ЭМ. Повышение метНb-восстанавли­вающей активности цит b 558III особенно в гетеро­генной фазе (в ЭМ) есть ответ адаптационных механизмов организма для сохранения кислород­ного гомеостаза и полноценной оксигенации клеток, причем усиление метНb-восстанавливающей активности цит b558III – характерное явление для ряда сердечно-сосудистых заболеваний [1]. При ЭГ несколько повышается уровень и активность супероксид-продуцирующего липопротеина сыво­ротки – супрола со снижением его стабильности (увеличивается степень агрегации и потери растворимости этого липопротеина). Это связано с увеличением уровня супероксидов, соответст­венно и перекиси водорода (как продукта фермен­тативного дисмутирования супероксидов [15]), и НО. - радикалов, которые стимулируют ПОЛ фосфолипидных остатков самого супрола, вызывая его агрегацию. Приведенные изменения супрола могут вызывать увеличение вязкости сыворотки, образование атеросклеротических бляшек внутри сосудов и нарушать гемодинамику при ЭГ. 

У больных ЭГ с неконтролируемым АД актив­ность антирадикальной защитной системы сыво­ротки крови и эритроцитов существенно снижена (характерный синдром ЭГ) [18, 21–23] (табл.1), это закономерно, если учесть то обстоятельство, что заметно увеличены уровень и активность МПА сыворотки и эритроцитов. При этом продуцирован­ные супероксиды могут превращаться в НО.- радикалы, которые способны необратимо инакти­вировать Cu,Zn-СОД, каталазу и ЦП. При повышенных концентрациях гидроксильные ради­калы также необратимо деградируют и МПА-изоформы цит b558 ЭМ in vitro [7]. С другой стороны, в ЭМ уровень СОД и каталазы невысокий, по сравнению с цитозолем эритроцитов, соответст­венно невысока и стационарная концентрация перекиси водорода [15] и гидроксильных ради­калов. Однако это не означает, что в ЭМ невозмо­жен процесс деструктирования изоформ цит b558 гидроксильными радикалами или другими актив­ными интермедиатами аэробного метаболизма. Это зависит и от других факторов, сопутствующих дестабилизации ЭМ при различных заболеваниях [3].

Снижение уровня МАА и повышение уровня МПА создает определенный дисбаланс между ними с характерным изменением антиоксидант­ного статуса (АС) (расчетный суммарный уровень МАА) и прооксидантного статуса (ПС) (рас­четный суммарный уровень МПА) сыворотки крови и эритроцитов (табл.2). Полученные резуль­таты служат основанием для применения комбини­рованной терапии с экзогенными препаратами антиоксидантной активности, в первую очередь хелаторами НО.-радикалов и препаратами с СОД-миметической активностью.

Таблица 2

Изменение АС и ПС (%) в сыворотке крови и эритроцитах у больных ЭГ с неконтролируемым АД по сравнению с 100% контрольными показателями донорской крови, Р‹0,03, n=8

 Таким образом, при неконтролируемой ЭГ моле­кулярно-биохимические механизмы оксидативного повреждения компонентов крови связываются: 

• с резким снижением стабильности ЭМ, как результат увеличения степени рилизинга изоформ цит b558 из ЭМ и комплексообразования Нb с этими изоформами, 
• с соответственным увеличением уровня МПА, 
• увеличением НАДРН-зависимой супероксид-продуцирующей и метНb-восстанавливающей активности цит b558III,
• со снижением стабильности супрола на фоне снижения уровня МАА, вызывая нарушение физиологического равновесия между МАА и МПА и изменение АС и ПС сыворотки крови и эритро­цитов.

Литература

1. Алексанян Серг.С., Симонян Г.М., Алексанян А.С., Симонян М.А. Вопросы теорет.клин.мед., 2004, 7 (4), с. 25–28.
2. Акопян В.П., Симонян М.А., Манукян А.А., Симонян Р.М., Акопян А.А. Бюлл.эксп.биол.мед., 2001, 11, с.527–529.
3. Симонян Г.М. Мед.наука Армении НАН РА, 2002, XLII, 2, с. 101–105
4. Симонян М.А., Галоян А.А., Симонян Г.М. ДНАН РА, 1997, 97, с. 62–66.
5. Симонян М.А., Симонян Г.М. Способ получения металлопротеинов крови. Лицензия изобрет. 341 Армпатента. Ереван, 1997.
6. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Способ получения цитохромов из мембран эритроцитов. Лицензия изобрет. 908 Армпатента. Ереван, 2001.
7. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. В кн.: Актуальные вопросы военной медицины. Гос.Мед. университет им.М.Гераци, Ереван, 1999, с.48–51.
8. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Карапетян А.В., Симонян М.А. Мед.наука Армении НАН РА, 2003, XLIII, 1, с.30–34
9. Симонян Р.М., Симонян Г.М., Бабаян М.А., Симонян М.А. Мед.наука Армении НАН РА, 2004, XLIV, 1, с.43–46.
10. Симонян Р.М., Симонян Г.М., Бабаян М.А., Симонян М.А., Галоян А.А. Мед.наука Армении НАН РА, 2003, XLIII, 3, с. 13–18.
11. Cazzola R., Randanelli M., Russo V.S. et al. J.Lipid.Res., 2004, 45(10), p.1846–1851.
12. Digiesi V., Fiorillo C., Cosmi L. et al. Clin.Ther., 2000, 151(1), p.15–18.
13. Donmez G., Derici U., Erbar D. et al. Jpn. J.Physiol., 2002, 52(2), p.435–440.
14. Jones S/A., O’Donnel V.B., Wood J.D. et al. Am.J.Physiol., 1996, 271(4Pt2), H1626-H1634.
15. Fridovich I. Annu.Rev.Biochem., 1995, V.64, p.97–112.
16. Fukui T., Lassegue B., Kai H. et al. Biochim.Biophys.Acta, 1995, 1231(3), p.215–219.
17. Kalinina N., Agrotis A., Tararak E. et al. Atherioscler. Thromb.Vasc.Biol., 2002, 22(12), p.2037–2043.
18. Krouf D., Bouchenak M., Mohammed M. et al. Hypertens. Res., 2005, 28(2), p.107–112.
19. Lacy F., Kailasam M.T., O’Conner D.T. et al. Hypertension, 2000, 36(5), p.878–884.
20. Muda P., Kampus P., Zilmer M. et al. J.Hypertens., 2005, 23(1), p.105–112.
21. Simin D.V., Mimic-Oka J., Pljesa-Ercegovac M. et al. J.Hum.Hypertens., 2006, 20(2), p.149–155.
22. Tandon R., Singh M.K., Garg H. et al. Natl.Med.J.India, 2005, 18(6), p.297–299.
23. Yasumari K., Maeda K., Nakamura M. et al. Hypertens.Res., 2005, 28(2), p.107–112.

Вопросы, ответы, комментарии