Оценка действия пирацетама на состояние процессов фосфорилирования АДФ и аккумуляции кальция в митохондриях сердца в условиях гипокинезии

Ключевые слова: гипокинезия, пирацетам, кальций, фосфорилирование АДФ, митохондрии, сердце

Изучение влияния гипокинезии (ГК) на организм установило взаимосвязь между степенью и про­дол­жительностью ограничения двигательной ак­тивности (ОДА) и процентом роста смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в современ­ном обществе [12]. Установлено, что продолжи­тельная ГК, представляющая собой состояние хрони­ческо­го стресса, приводит к нарушению синтеза АТФ в митохондриях миокарда, что отри­цательно сказы­вается на деятельности сердечно-сосудистой системы [2]. Это дает основа­ние считать, что энергетический обмен является од­ним из ведущих факторов, определяющих фор­мирование индиви­дуаль­ной резистентности организма [5].

Исследование процессов биоэнергетической адаптации сердца при различных стрессорных воздействиях показывает, что одним из основных показателей энергетического состояния могут считаться процессы фосфорилирования АДФ и транспорта кальция в митохондриях миокарда [4].

Поиск средств фармакологической коррекции, нормализующих нарушенные биоэнергетические процессы в митохондриях, показывает эффектив­ность применения пирацетама при различных нарушениях энергетического обмена в сердце [1,11].

Целью данного исследования явилась оценка эффективности действия пирацетама на процессы фосфорилирования и транспорта Са²⁺ в мито­хондриях сердца в различные сроки ГК.

Материал и методы

Эксперименты проводились на 45 белых беспородных крысах-самцах массой 180 – 200г. ГК моделировалась помещением крыс в индиви­дуальные клетки-пеналы. Животные были раз­делены на следующие группы: 

1. Интактные крысы в качестве общего конт­роля.
2. Контрольные крысы, которым в течение 10 дней ежедневно внутрибрюшинно (в/б) вводили пирацетам в дозе 100мг/кг массы.
3. Животные, находящиеся в состоянии ГК 15, 30 и 45 суток без введения препарата.
4. Экспериментальные животные, находящиеся в условиях ГК и получавшие в/б пирацетам в дозе 100мг/кг массы за десять дней до наступления соответствующего срока ГК. Животных забивали на 15, 30 и 45-е сутки ГК. 

Митохондрии из ткани сердца выделяли методом дифференциального центрифугирования [8]. Инкубационная среда имела следующий сос­тав: 0,1М сахарозы; 60мМ КСI; 1,5мМ К₂НРО₄; 1,5мМ Трис*НСI; рН~7,45±0,10, а субстрат окисления – сукцинат в концентрации 10мкМ.

Процессы фосфорилирования АДФ оценивались по Н⁺-поглощающей способности митохондрий после добавления 400 мкМ АДФ. Измерения рН и концентрации Са²⁺ проводились в одной и той же пробе [10]. Показания регистрировались после каждой добавки: субстрата, суспензии митохонд­рий, а также при титровании раствором кальция хлорида (по 120, 200 и 240 нМ). Кальциевая емкость оценивалась по суммарному поглощению Са²⁺ из среды. Одновременная регистрация измерений с помощью электродов проводилась на двух рН-метр/ионометрах pIONeer-45 фирмы Radiometer Analytical. Временная регистрация изменения концентрации Са²⁺ в буфере осуществ­лялась путем соединения прибора соответствую­щим кабелем с компьютером, где с помощью компьютерной программы IONFile проводилась автоматическая запись данных, позволяющая получать графическое изображение изменения концентрации Са²⁺ в инкубационной среде Са-се­лек­тивным электродом. Концентрацию митохонд­риального белка определяли методом Лоури [14].

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Microsоft Office Excel 2003. Достоверность полученных данных оценивалась с помощью t­критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Результаты по изучению процессов поглощения Н⁺ митохондриями сердца в различные сроки ГК и у контрольных животных представлены в табл.1. О синтезе АТФ в митохондриях мы судим косвенно по поглощению Н+, так как согласно Ленинджеру при добавлении АДФ к суспензии митохондрий при рН~7,4 происходит связывание протонов в соот­ношении приблизительно 1:1, т.е. можно утверж­дать, что поглощенное количество протонов экви­валентно количеству синтезированного АТФ [3].

Как видно из представленных данных, в условиях ГК во все исследуемые сроки происходит статистически достоверное уменьшение Н+-связывающей функции митохондрий. Так, исходя из полученных результатов, на 15, 30 и 45-е сутки ГК продукция АТФ уменьшается соответственнона 41,2; 51,4 и 49,5%.

Таблица 1

Влияние пирацетама в дозе 100 мг/кг массы на поглощение Н+ при добавлении 400мкМ АДФ (в мкМ Н⁺/мг белка_мит) митохондриями сердца интактных и опытных крыс, находящихся в различных сроках гипокинезии (M± m)

Примечание. Достоверность изменений рассчитана относи­тель­но интактной группы, * р ‹ 0,05–0,01;

** p ‹ 0,001

Таким образом, судя по данным о Н⁺-связываю­щей способности суспензии митохондрий в при­сутствии АДФ, можно сказать, что в митохондриях сердца выявляются выраженные изменения в синтезе АТФ, причем степень сдвигов зависит от продолжительности действия ОДА. 

Причинами подобных изменений могут быть изменения нейрогуморальной регуляции организма, приводящие к сдвигам в содержании катехолами­нов и кортикостероидов, а также повышению уровня неэстерифицированных жирных кислот в крови в условиях ГК, что создает комплекс метаболи­ческих сдвигов, приводящих к разобщению и подавлению процессов окислительного фосфорили­рования в митохондриях миокарда [9,15].

Введение пирацетама в указанной дозе конт­рольной группе крыс вызывает подавление Н+-связывающей способности митохондрий, однако в условиях ГК действие препарата проявляет противоположную направленность. Так, на 15-е сутки ГК введение пирацетама приводит к резкому усилению поглощения Н⁺ суспензией митохондрий, которое превышает нормальный уровень поглоще­ния Н⁺ на 37,2%, а по сравнению с соответст­вующим сроком возрастает на 133,2%. Однако на 30-е сутки ГК препарат хотя и оказы­вает стиму­лирующее действие, повышая Н+-связы­вающую способность митохондрий по сравнению с показа­телем данного периода на 63,4%, однако последний остается статистически достоверно низким по сравнению с интактной группой. Из данных видно, что на 45-е сутки ГК влияния препарата не наблю­дается.

Для более полной оценки выявленных изменений ниже приведена скорость поглощения Н+ мито­хондриями сердца при добавлении 400мкМ АДФ в инкубационную среду.

Рисунок. Влияние пирацетама в дозе 100 мг/кг массы на скорость поглощения Н+ при добавлении 400мкМ АДФ (в мкМ Н+/мг белка_мит*мин) митохондриями сердца интактных и опытных крыс, находящихся в различных сроках гипокинезии

Из рисунка видно, что скорость процессов связы­вания Н+ митохондриями в условиях ГК умень­шается, причем наиболее выраженно на 30-е сутки, когда отмечается самый низкий показатель связывания протонов. Из динамики изменений скорости поглощения Н⁺ на фоне введения пирацетама видно, что только на 15-е сутки отме­чается резкое увеличение скорости связыва­ния Н⁺ митохондриями сердца, в то время как в контроле и на 30-е и 45-е сутки показатель скорости остается ниже нормы (р‹0,01).

Таким образом, можно предположить, что механизмы, ответственные за поддержание адек­ватного синтеза АТФ в митохондриях сердца при ГК и на фоне введения пирацетама, исто­щаются по мере продолжительности ОДА. 

В настоящее время доказано, что существует определенная взаимосвязь между процессами энергетического метаболизма и кальциевым гомеос­тазом, при которой вне зависимости от типа ткани перегрузка цитозоля и митохондрий ионами кальция запускает целый каскад биохимических изменений, приводящих к нарушению энергообразо­вания, в частности синтеза АТФ [13]. Нужно отме­тить, что кальциевая перегрузка митохондрий счи­тается важнейшей первопричиной апоптоти­ческих изменений в миокарде [6,7].

Учитывая тесную взаимосвязь между транс­портом Са²⁺ и процессами энергообразования в митохондриях, для выяснения возможных причин подавления синтеза АТФ и механизмов действия пирацетама в условиях ГК, была определена Са²⁺-аккумулирующая способность митохондрий сердца у интактных и экспериментальных крыс, находя­щихся в различных сроках ГК.

Таблица 2 

Изменения количественных показателей Са²⁺-аккумулирующей способности (мкМСа²⁺/мг белка_мит) при введении пирацетама в дозе 100мг/кг массы в митохондриях интактных и опытных крыс, находящихся в различных сроках гипокинезии (M± m)

* p‹ 0,001

Экспериментальные данные по изучению Са²⁺-аккумулирующей способности митохондрий сердца, представленные в табл.2, показывают, что во все исследуемые сроки ГК происходит резкое подавление захвата Са²⁺. Однако по мере увеличения продолжительности ГК аккумуляция Са²⁺ митохондриями сердца проявляет тенденцию к увеличению. Результаты исследований показывают, что при введении пирацетама у контрольных животных изменения Са²⁺-аккумулирующей способности митохондрий не наблюдается. Однако, несмотря на то что на 15-е и 30-е сутки ГК уровень поглощения Са²⁺ остается значительно ниже контрольного, по сравнению с соответствующими сроками происходит значительное повышение Са²⁺-аккумулирующей способности митохондрий сердца в 6,5 и 2,3 раза соответственно, что также проявляется и на Н+-связывающей способности митохондрий, т.е. на синтезе АТФ.

На основании приведенных выше исследований можно прийти к выводу, что ГК приводит к резкому снижению синтеза АТФ, в особенности на 30-е сутки, в то время как Са²⁺-аккумулирующая способность митохондрий сердца во все сроки ГК резко подавляется. Введение препарата в/б в указанной дозе стимулирует синтез АТФ на 15-е и 30-е сроки ГК, однако не оказывает выраженного положительного воздействия на Са2+-аккумулирующую способность митохондрий сердца в прослеживаемые сроки ОДА.

Литература

1. Аведисова А.С., Ахапкин Р.В., Ахапкина В.И., Вериго Н.И. Пирацетам в свете современных исследований (анализ зарубежных исследований). Рос. психиатр. журнал, 2001, 1, с. 46-53.
2. Коваленко Е.А. О проблеме гипокинезии в современной медицине. В сб.: Гипокинезия. Медицинские и психоло­гические проблемы. Тез. докл. конференции. М.,1997, с.35-36.
3. Ленинджер А. Митохондрия. М., 1966, с. 315.
4. Литвицкий П.Ф. Патогенные и адаптативные изменения в сердце при его регионарной ишемии и последующем возобновлении коронарного кровотока. Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 2002, 2, с. 2-12.
5. Лукьянова Л.Д. Роль биоэнергетических нарушений в патогенезе гипоксии. Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 2004, 2, с. 2-11.
6. Меерсон Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. М., 1984, с. 272.
7. Постнов Ю.В. Недостаточность образования АТФ в связи с кальциевой перегрузкой митохондрий как источник повышения артериального давления при первичной гипертензии. Кардиология, 2005, 10, с.4-11.
8. Прохорова М.Н. Методы биохимических исследований. Л., 1982.
9. Соцкий О.П., Карапетян В.А., Лорян И.Ж., Жамгарян Л.Г. Влияние длительной гипокинезии на уровень катехоламинов, серотонина и активность митохондриаль­ной сукцинатдегидрогеназы миокарда и печени белых крыс. Мед. наука Армении НАН РА, 2004, т. XLIV, 1, с. 21-26.
10. Тугай В.А., Усатюк П.В. Одновременная регистрация изменений концентрации Са2+ и рН при изучении процессов транспорта кальция в саркоплазматическом ретикулуме. Укр. биохимический журнал, 1979, т. 51, 5, с. 508-510.
11. Цорин И.Б., Чичканов Г.Г. Влияние пирацетама на деятельность, функциональное состояние и кровоснаб­жение ишемизированного миокарда. Материалы 4-ой международной конференции “Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам”, 2006, с. 78.
12. Booth W. Frank, Chakravarthy V. Manu, Gordon E. Scott, and Spangenburg E. Espen. J. Waging war on physical inactivity: using modern molecular ammunition against an ancient enemy, J. Appl. Physiol., 2002, 93.,p.3-30.
13. Dong Z., Saikumar P., Weinberg J.M., Venkatachalam M.A. Calcium in cell injury and death, Ann. Rev. Pathol. Mech. Dis., 2006, 1, p. 405-434.
14. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. J. Biol. Chem., 193, 1951, p.265-275.
15. Ventura-Clapier R., Garnier A., Veksler V. Energy metabolism in heart failure, J. Physiol., 2003, Vol.555, p.1-13.

Вопросы, ответы, комментарии