Последние десятилетия XX века ознаме­но­ва­лись развитием молекулярной медицины, oбусловившим прогресс во многих областях медицинской науки (Faller D., 1999). Ряд про­веден­ных в последние годы эксперименталь­ных работ позволил досконально изучить клеточные и молекулярные механизмы разви­тия ИБС (Risau,1997), что дало возможность рассматривать лечение ишемической болезни сердца в свете новых возможностей генной инженерии. Так, решающие достижения про­грам­мы Геном человека позволили идентифи­ци­ровать гены, мутации которых приводят к наследственным болезням или увеличивают риск многофакторных заболеваний (Franz W-M., Rothmann T., Frey N., Katus H., 1997), что и обусловило появление генной терапии – новой стратегии в лечении как наследствен­ных, так и мультифакториальных и ненаслед­ствен­ных болезней, направленной либо на замещение функции деффектного гена, либо на экспрессию генных продуктов, обладающих терапевтическим эффектом.

Целью исследования явилось изучение влияния фактора роста ангиогенеза VEGF на структурное состояние и капиллярную сис­тему миокарда крыс при экспериментально индуцированном инфаркте.

Материал и методы. В качестве животной модели были использованы крысы-самцы, (белые, vistar, нелинейные), массой 200-250г. Первую группу животных составили интакт­ные крысы (n=6), вторую – контрольные по­доп­ыт­ные животные (п=8), которым прово­дили окклюзию левой передне-нисходящей ко­ро­нарной артерии (ЛКА). Третьей группе подопытных животных (п=8) внутривенно вводили VEGF-164 в дозе 0,3 мкг/кг с пред­ва­ритель­ной окклюзией коронарной артерии. Препарат VEGF (производство компании Bio Sourca, Inc. USA) вводили в дозе 0,3 мкг/кг после растворения в 1 мл буферного раствора и центрифугирования в течение 5 мин. Пре­па­рат вводили интрамиокардиально.

20 крыс под общей анестезией (нембутал 40 мг/кг, внутрибрюшинное введение) были инту­би­рованы с подключением к аппарату искус­ствен­ного дыхания (за 5 минут до анестезии проводилось внутримышечнoe введение атро­пи­на 0,04 мкг/кг с целью предотвращения отека слизистой оболочки при проведении ин­ту­бации). После осуществления левой гори­зонталь­ной торакотомии между IV и V ребром производилась перевязка левой нисходящей артерии 7,0 PROLENE, полипропиленовой нитью. В постоперационном периоде обеспе­чи­вался активный отсос воздуха и жидкости для предотвращения пневмоторакса, а также внутримышечная инъекция гентамицина (0,7мг/кг) или ципрофлоксацина (0,4 мг/кг). Всем 16 животным непосредственно после перевязки коронарной артерии производилось внутримиокардиальное введение СЭФР (VEGF) и осуществлялся дальнейший кон­троль состояния коронарного кровообраще­ния на 7-й и 14-й дни.

Декапитацию производили на 7-й день после окклюзии в условиях нембуталовой анестезии.

Приготовление раствора VEGF для внутри­ми­­окар­диального введения подопытным кры­сам проводилось по следующей методике:

• приготовление буфера-phosphate buffer soline with 0,14 bovine serum albumine: пред­ва­рительно используя дистиллированную воду, по­лу­чили фосфатный буфер следующего состава:

NaCl - 9,0 dg/l,

Na2HPO4 - 0,703 dg/l,

KH2PO4-0,232dg/l,

Ph = 7,2.

Далее с помощью вышеуказанного фос­фат­но­го буфера был получен 0,1% раствор BSA (bovum serum albuminum).

• непосредственно приготовление раствора VEGF осуществляли растворением 10мг пре­па­рата в 1мл 0,1% буферного раствора, цен­три­фугированием в течение 5 минут. Вводили по­лу­чен­ный раствор животным внутримиокар­диаль­но из расчета 0,3 мг/кг.

При приготовлении препарата для изучения морфологического состояния миокарда ис­поль­зо­вался общепринятый метод окраски гематоксилин-эозином.

Гемомикроциркуляторное русло изучалось на микроскопических препаратах миокарда, обработанных модифицированным методом Гомо­ри: сердце животных изолировалось, хранилось в 5% растворе формалина с целью фиксации (2-3 дня); были сделаны срезы на разных уровнях сердечной мышцы (в коли­чест­ве 25-30 штук) и кусочки миокардиальной ткани толщиной 60-90 мкм были помещены в инкубационный раствор и хранились в термостате (370С) в течение 2-3 дней, после чего срезы миокардиальной ткани окрашива­лись глицерин-желатином.

Полученные препараты миокарда изуча­лись с помощью окуляр-макрометра: измеря­л­ся средний диаметр капилляров (d), рассчи­ты­ва­­лись плотность (общая длина–L), обменная поверхность капилляров (ОПК) и емкость ка­пил­ляр­ного русла (ЕКР) на 1мм3 миокардиаль­ной ткани.Статистическая обработка данных проводилась по t- критерию Стьюдента.

Результаты исследования. Полученные нами данные, показали, что на 7-й день после окклюзии в

очаге некроза обнаруживалось значительное количество некротических эле­мен­тов и единичные фрагменты капилляров, тогда как после введения VEGF сосудистая реакция была более выражена.

При исследовании микроциркуляторного русла миокарда у интактных животных были выявлены параллельно рас

положенные и рав­но­мерно наполненные капилляры, а также поперечная исчерченность кардиомиоцитов (рис. 1).

Рис. 1. Миокард интактных животных. Параллельно расположенные капилляры и поперечная исчерченность мышечных волокон, 7x40

У контрольных животных выявлено нали­чие многочисленных светлых полей, лишен­ных сосудистых элементов. В соседних с нек­ро­зом участках миокарда – густо располо­жен­ные и неравномерно заполненные капилляры. Одновременно с этим стенки капилляров окрашивались более интенсивно, многие из них извитые, с неравномерными контурами. Во многих полях зрения полностью отсутству­ет поперечная исчерченность мышечных воло­кон (рис. 2).

Рис. 2. Окклюзия левой коронарной артерии. Паранекротическая зона.Контуры капилляров неровные, окраска стенок неравномерная, капилляры образуют микроаневризматические расширения, 10x40

В миокарде животных,получивших VEGF, обнаруживалось более плотное расположение капилляров,анастомозирующих друг с другом и образующих своеобразную капиллярную сеть в участках, непосредственно приле­га­ющих к некрозу (рис. 3).

Рис. 3. Сформировавшаяся капиллярная сеть в участках миокарда, прилегающего к некрозу на 7-й день после окклюзии коронарной артерии, 10x40

В более отдаленных от некроза отделах ка­пил­ляры располагались параллельно друг к другу, имея правильный ход с ровными кон­ту­рами.

При морфометрической оценке капил­ляр­ной системы перинекротической зоны средний диаметр капилляров почти не изменялся в пределах достоверности (3,3%, Р>0,1) от тако­вого у контрольных животных. Отмечалось уве­ли­чение плотности функционирующих ка­пил­ляров (14,7%, Р<0,05) и ОПК (12,1%, Р<0,05) в этих участках (таблица).

Таблица. Морфометрические изменения микроциркуляторного русла миокарда в перинекротической зоне при окклюзии ЛКА и применении VEGF

*P(0,05 –достоверность разницы с интактными животными, #P(0,01 – достоверность разницы между животными с окклюзией ЛКА и получившими VEGF

В более отдаленных отделах миокарда ка­пил­ляры располагались параллельно друг к другу, их средний диаметр и количество функ­ци­онирующих капилляров в пределах досто­вер­ности не отличались от таковых в перинекротической зоне.

В группе животных, получивших предвари­тель­­ную инъекцию VEGF-164, отмечалось более плотное расположение капилляров как в пе­ринекротической зоне (увеличение на 24,8%, Р<0,01), так и в отдаленных от него участ­ках. Морфометрические измерения по­ка­зали отсутствие изменения среднего диа­мет­ра капилляров от таковых у контрольных крыс (2,8%, Р>0,1), однако при этом число функ­ци­онирующих капилляров достигало дос­то­верно больших значений как в пери­некро­ти­чес­кой зоне (24,8%, Р<0,01),так и в отдален­ных от него участках. Именно благодаря уве­ли­чению количества функционирующих ка­пил­ляров наблюдалось значительное увели­че­ние ОПК (25,1%, Р<0,01) (таблица).

Таким образом, на модели эксперименталь­ного некроза и терапии фактором ангиогенеза VEGF, установлено, что терапия VEGF акти­ви­рует процесс ангиогенеза как в перинекро­ти­­ческой зоне, так и отдаленных от некроза зонах путем повышения количества функци­о­ни­­рующих капилляров и обменной поверх­нос­ти капиллярного русла.

Имеется ряд нерешенных вопросов от­но­ситель­но методов введения VEGF с целью тера­певти­ческого ангиогенеза. Внутривенное введение или введение в дистальный арте­ри­аль­ный кровоток ангиогенных факторов роста может явиться причиной системных реакций. В связи с этим интрамиокардиальное введение VEGF может явиться более безопасным. Учитывая вышеизложенное, в наших экспе­ри­мен­тах опробирован данный метод введения VEGF.

Литература

1. Dichek D.A., Anderson J., Kelly A.B. et al. Cir­cu­lation, 1996, 93, p. 201-209.
2. Flugelman M.Y., Jaklitsch M.T., Newman K.D. et al. Circulation, 85, 1992, p. 1110-1117.
3. Feldman L.J., Pastore C.J., Aubailly N. et al. Gene Ther., 1997, 4, p. 189-198.
4. Fan T.P., Jaggar R., Bicknell R. Trends Pharmacol. Sci., 1995, 16, p. 57-66.
5. Guzman R.J., Hirschowitz E.A., Brody S.L et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994,  91, p.     10732-10736.
6. Gerszten R.E., Luscinskas F.W., Ding H.T. et al. Circ. Res., 1996, 79, p. 1205-1215.
7. Ohno T., Gordon D., San H. et al. Science, 1994,  265, p. 781-784.
8. Laitinen M., Hartikainen J., Eranen J. et al. Hum. Gene Ther., 2000, 11, p. 263-270.
9. Landau C., Pirwitz M.J., Willard M.A. et al. Am. Heart J., 1995, 129, p. 1051-105718.
10. Schulick A.H., Vassalli G., Dunn P.F. et al. J. Clin. Invest., 1997, 99, p. 202-219.
11. Lewis B.S., Flugelman M.Y., Weisz A. et al. Cardiovascular Res., 1997,  35, p.  480-489.
12. Marshall E. Science, 1999,  286, p. 2244-2245.
13. March K.L., Madison J.E., Trapnell B.C. Hum. Gene Ther., 1995,  6, p. 41-53.
14. Newman R.L., Dunn P.F., Owens J.W. et al. J. Clin. Invest., 1995, 96, p. 2955-2965.