Острофазовая реакция, развивающаяся при критических состояниях, контролируется провоспалительными медиаторами и их эндогенными антагонистами - за счет баланса между цитокинами в нормальных условиях создаются предпосылки для заживления ран, уничтожения патогенных микроорганизмов, поддержания гомеостаза. Однако в том случае, если регулирующие системы не способны поддерживать гомеостаз, начинают доминировать деструктивные эффекты цитокинов и других медиаторов, что приводит к нарушению проницаемости и функции эндотелия капилляров, формированию отдаленных очагов системного воспаления, развитию моно- и полиорганной дисфункции [9,14,16,29].

В многочисленных исследованиях при различных патологиях обнаружено наличие достоверной корреляции между плазменными уровнями какого-либо конкретного цитокина и выживаемостью. По литературным данным [12,22,24], несомненной значимостью обладают цитокины семейства ФНО, уровни растворимых рецепторов которых могут быть хорошим прогностическим фактором исхода. Не менее информативны ИЛ-1 и его антагонист (раИЛ-1), высокие уровни последнего свидетельствуют о понижающей регуляции ответа хозяина [25]. Плазменные уровни ИЛ-6 также повышены у больных с плохим исходом [21].

Выявление наиболее информативных ранних маркеров воспаления для иммунологического мониторинга у больных с политравмой могло бы способствовать своевременным мероприятиям по предотвращению развития нарушений гомеостаза иммуновоспалительного ответа. Реакция организма на травму контролируется провоспалительными медиаторами – интерлейкинами (ИЛ-2,3,12), ИФН-γ и фактором некроза опухоли (ФНО-α), а также их эндогенными антагонистами - интерлейкинами (ИЛ-4,5,6,10), растворимыми рецепторами к ФНО и ИЛ-1 [14,26], при этом, однако, нет четких критериев повреждающих уровней цитокинов и баланса их [2,23].

Что касается сепсиса, в настоящее время установлена диагностическая ценность измеряемых в крови концентраций ИФН-альфа и - гамма, определение сывороточных концентраций ИЛ-1,2,4,6,8,10, ФНО-альфа, в настоящее время предлагается не только для стандарта иммунологического обследования, но также и для дифференциации стадий гнойно-септических осложнений [15,27,28]. При этом, согласно литературным данным [14,22,29], именно дисбаланс цитокинов, а не общий уровень гиперцитокинемии является характерным в патогенезе тяжелого сепсиса. Учитывая вышеизложенное, нами изучены сывороточные и индуцированные концентрации некоторых цитокинов у больных с множественными травмами и сепсисом, и сопоставлены с клиническим течением заболевания.

Материал и методы. Изучена способность к продукции in vitro, а также спонтанный и сывороточный уровни основных медиаторов I и II типа, обеспечивающих развитие иммунного ответа по клеточному или гуморальному пути - гамма-ИФН, ФНО-альфа, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, раИЛ-1 и ИФН-альфа, у 53 больных с множественной и сочетанной травмой и у 23 больных с сепсисом, развившимся как послеоперационное или посттравматическое осложнение, госпитализированных в ОИТ Медицинского центра Эребуни.

Концентрацию цитокинов в сыворотках крови и в культуральной жидкости оценивали методом твердофазного ИФА посредством наборов Diaclone (France) и ЗАО Вектор-Бест, Новосибирск.

Для определения способности к продукции изучаемых цитокинов выделенные из периферической крови лимфоциты в концентрации 2 млн/мл культивировали в среде RPMY-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой и фитогемагглютинином (ФГА) в дозе 10 мкг/мл в течение 72 час. Полученные супернатанты хранили при - 200С до тестирования.Этапы проводимых исследований соответствовали стадиям развития иммунного ответа [12]: I – 1-4-е сутки фаза индукции, –II –8-10-е сутки – иммунорегуляторная (пролиферативная) фаза, III –11- 24-е сутки –эффекторная (продуктивная) фаза.

Среднее арифметическое вариационного ряда (M), средняя ошибка среднего арифметического (±m), достоверность различий параметров определялись по критерию Стьюдента (t). Корреляционный анализ между изучаемыми показателями проводили по методу Pearson (r).

Результаты и обсуждение. Политравма. Сравнительный анализ изучаемых сывороточных цитокинов (рис. 1) у больных с политравмой, проведенный с учетом стадий иммунного ответа, показал, что уровень сывороточного ИФН-альфа на протяжении всех трех этапов исследования оставался почти в пределах нормы (низкие титры – от 22.2 до 27.9 пг/мл - 37% случаев).

Рис. 1. Уровень сывороточных цитокинов у больных с политравмой в зависимости от стадий иммунного ответа: норма–ИЛ-4 < 20 пг/мл, ИФН-альфа < 25 пг/мл, ФНО-альфа < 2.5 пг/мл, ИЛ-1РА <1000 пкг/мл, ИЛ-6<40 пкг/мл, ИЛ-8<30 пкг/мл

Не отмечено также значимого повышения как сывороточного, так и индуцированного уровней ИЛ-4 - лишь у шести пациентов (один с летальным исходом) на III стадии исследования наблюдали увеличение сывороточной концентрации его до 179.9 пг/мл (табл.1).

Таблица 1. Продукция цитокинов in vitro в динамике лечения у больных с политравмой

* разница показателей по сравнению со здоровыми достоверна (p<0.005),

** разница показателей достоверна по сравнению с I стадией исследования (p<0.005)

Содержание сывороточного ФНО-альфа у обследуемых было достоверно выше нормы, оставаясь, практически, на том же уровне до конца лечения (17.5±1.56 и 19.2±1.84 пг/мл). У большинства больных в I стадии исследования, на фоне общего возрастания сывороточной концентрации ФНО-альфа, отмечался достаточно высокий уровень индукции данного цитокина, не снижающийся вплоть до III стадии. Лишь у части больных с летальным исходом (22%), начиная со II стадии исследования, наблюдалось понижение как индуцированного, так и спонтанного уровней ФНО-альфа.

Согласно полученным данным, наиболее информативным показателем оказался ИФН-гамма. Его продукция на I стадии исследования у всех больных значительно превышала норму, снижалась к концу лечения более, чем в 2 раза, не достигая, однако, значений нормы (320.2±27.4 и 145.8±9.4пг/мл соответственно), за исключением показателей обследуемых с летальным исходом (группа А), у которых уровень ИФН-гамма повышался или практически не претерпевал изменений (рис. 2).

Рис.2. Продукция ИФН-гамма у больных с политравмой в зависимости от летальности

Эти показатели были сопоставлены с данными, касающимися сывороточных уровней ИЛ-6 и ИЛ-8, где также прослеживалась зависимость от результата лечения (рис. 3).

Концентрации ИЛ-8 при I исследовании находились в пределах нормы у большинства выздоровевших больных, однако уже ко II исследованию нами отмечена зависимость этого показателя от выживаемости – почти двукратное нарастание уровня его у больных с летальным исходом (группа А) –он составил 69.2±6.1пг/мл, тогда как у выздоровевших больных (группа Б) уровень его оставался в норме и равнялся 41.5±1.6 пг/мл, еще более снижаясь к II исследованию – 6.9±0.7 пг/мл. Выраженная разница выявлена и в отношении ИЛ-6 (рис. 1) – у больных группы А в III исследовании сывороточный уровень его достигал 677.2±69 пг/мл, более чем в 15 раз превышая норму, тогда как у больных с благоприятным исходом (группа Б) этот показатель снижался к концу лечения, не достигая, однако, нормальных значений (116.4±6.5 пг/мл).

Повышение концентраций ИЛ-6, одной из основных функций которого является регуляция процессов созревания антителообразующих клеток и продукции сывороточных иммуноглобулинов, в I фазе исследования, возможно, отражает активацию синтеза антител, как известно, в значительной степени страдающего при политравме. Полученные нами данные демострируют выраженную зависимость между повышенными сывороточными уровнями ИЛ-6 и ИЛ-8 и исходом заболевания: в течение всего срока наблюдения концентрации их у не выживших больных оставались неизменно высокими, тогда как при благоприятном исходе у пациентов отмечалось равномерное снижение содержания обоих цитокинов к конечному сроку наблюдения. Та же зависимость отмечена в отношении индуцированной продукции ИФН-гамма, остававшейся неизменно повышенной у пациентов с летальным исходом.

Сепсис. Для определения клинической значимости цитокинового статуса у больных с сепсисом нами были изучены те же параметры цитокиновой системы (ИФН – альфа, -гамма, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, раИЛ-1 и альфа-ФНО) в динамике лечения. Анализ полученных данных показал, что изначально повышенный уровень как про-, так и противовоспалительных цитокинов у всех обследованных больных к 10-м суткам недостоверно снижался (за исключением альфа-ФНО и ИФН-гамма, уровни которых уже при I исследовании незначительно отличались от нормы). Усредненные сывороточные уровни изученных цитокинов представлены в табл. 2.

Таблица 2. Сывороточный уровень цитокинов у больных с септической патологией в динамике лечения

* разница между показателями I и III исследования статистически достоверна (p< 0.05)

Из всех изученных нами цитокинов наиболее повышенным было содержание раИЛ-1, при этом уровень его коррелировал с исходом заболевания. В I фазе исследования сывороточный уровень раИЛ-1 был повышен у 70% больных (2559+25.4 пг/мл) – при II и III исследовании наблюдалась тенденция к снижению этого показателя – соответственно 1984+17.8 пг/мл и 1511+16.2 пг/мл, что, возможно, свидетельствует о регрессии системной воспалительной реакции и отсутствии регуляторной основы для формирования общей иммунодепрессии у этих больных. В то же время у больных с неблагоприятным прогнозом (5 из 23) изначально высокий уровень этого цитокина на протяжении всего периода лечения еще более повышался – соответственно 2410+27.1 и 2935+36.5 пг/мл.

В литературе имеются данные о том, что низкие концентрации раИЛ-1 связаны с худшим прогнозом [29], возможно, объясняемые отсутствием или ограничением эндогенной активности ИЛ-1, индуцирущего состояние, подобное септическому шоку [25,28], а, по данным [12], раИЛ-1 и ФНО играют главную роль в регуляции воспаления при сепсисе, отвечая за многочисленные системные эффекты. воспалительной реакции. Сывороточный уровень альфа-ФНО незначительно отличался от контрольного при I исследовании (у 14 из 23 больных), оставаясь таковым вплоть до конца лечения. Сывороточная концентрация ИФН-гамма также была снижена у большинства больных (в 86 % случаев), эти данные коррелировали с индуцированной продукцией его in vitro (рис. 4).

Рис. 4. Продукция in vitro гамма-ИФН в динамике лечения у больных с септической патологией

При I исследовании индуцированная продукция ИФН-гамма составила 77.4±8.2, недостоверно повышаясь к концу исследования – соответственно 105.3±12.3 и 112.4±12.9. Концентрация в сыворотке ИФН-альфа, изначально несколько повышенная, оставалась практически неизменной, при этом, нами не отмечено зависимости от исхода заболевания. Что касается показателей ИЛ-6 и ИЛ-8, концентрация первого в сыворотке крови, при 1 исследовании повышенная у более чем половины больных, еще более повышалась ко второму иследованию и несколько снижалась к концу исследования (соответственно 262.9±25.8, 376.6±29.3 и 96.7±8.4 пг/мл), тогда как усредненный уровень ИЛ-8 был незначительно повышен при I исследовании в 80 % случаев (56.2±4.9 пг/мл), и также снижался к концу исследования, незначительно отличаясь от нормы (38.5±4.1 пг/мл). Наблюдаемое повышение концентраций ИЛ-6 и ИЛ-8, возможно, является маркером тканевой деструкции, а увеличение в сыворотке крови концентрации рецепторного антагониста ИЛ-1 служит дополнительным признаком развивающегося воспаления.

Нами произведен корреляционный анализ (Pearson Correlation) изученных показателей цитокинового статуса у обследованных групп больных с политравмой и сепсисом. При изучении сывороточных уровней у больных с политравмой положительная корреляция (статистически достоверная) отмечена между γ-ИФН и α-ИФН; γ-ИФН и α-ФНО, α-ФНО и ИЛ-4. Исследование in vitro продукции цитокинов в динамике лечения у больных с политравмой выявило корреляцию между индуцированной и спонтанной продукцией ИЛ-4 и индуцированной и спонтанной продукцией α-ФНО. γ-ИФН не коррелировал ни с одним из оставшихся цитокином. Положительная корреляция сывороточных уровней цитокинов у больных с септическими осложнениями отмечена между раИЛ-1 и ИЛ-8 и между γ-ИФН и α-ФНО.

Заключение. Итак, повышенный исходный уровень провоспалительных цитокинов и последующее выраженное их снижение у больных с политравмой, возможно, отражают изменение направленности иммунного ответа в процессе лечения в результате переключения доминирующего изначально клеточного -Th-1-типа, на гуморальный, что следует расценивать как благоприятный прогностический показатель, а отсутствие у больных с летальным исходом значимых изменений сывороточных и индуцированных концентраций цитокинов, возможно, является признаком развивающегося истощения ресурсов иммунной системы и, как следствие, ее ареактивности. Достоверное повышение уровней индуцированного ИФН-гамма и ФНО-альфа (Th1-цитокинов) у больных с тяжелой множественной травмой позволяет использовать их в качестве дополнительных критериев иммунодиагностики.

Мониторинг уровней ИЛ-6 и ИЛ-8, на различных этапах исследования, также может явиться одним из методов наблюдения для прогноза риска развития несостоятельности противоинфекционного иммунитета, коррелируя с общим клиническим индексом тяжести в качестве одного из показателей ССВР, который выявляется в большей степени по клиническим симптомам, и очень ограниченному перечню лабораторных признаков.В то же время дисбаланс цитокиновой регуляции при сепсисе выражался в большей степени в отношении факторов регуляторной иммуносупрессии (раИЛ-1), чем нарушением соотношения про- и противовоспалительных цитокинов на фоне общего уровня гиперцитокинемии.

О цитокиновом дисбалансе свидетельствуют и низкие уровни альфа-ФНО – эти данные подтверждаются сообщениями в литературе [22,29] об информативности соотношения раИЛ-1/альфа-ФНО, наиболее адекватно характеризующего значительное преобладание у септических больных иммуносупрессорных цитокинов, что может рассматриваться как дополнительный критерий общей иммунодепрессии. Динамика изменений раИЛ-1, как фактора регуляторной иммуносупрессии на фоне общего уровня гиперцитокинемии, возможно, является одним из интегративных критериев цитокиновой дезрегуляции при нарастании иммунных расстройств, сопутствующих тяжелому сепсису, и может рассматриваться как показатель, характеризующий взаимоотношение иммунодепрессивной и воспалительной регуляторных систем, однако диагностическая и прогностическая информативность этого показателя нуждается в дополнительном исследовании.

Литература

1. Агаджанов В.В. Политравма.Септические осложнения. Новосибирск: Наука, 2005, 385 с.
2. Агаджанов В.В., Пронских А.А.,Устьянцева И.М. с соавт. Политравма. Иммунологические аспекты политравмы. Новосибирск: Наука, 2003, 492 с.
3. Афонин А.Н. Oсложнения тяжелой сочетанной травмы.Современное состояние проблемы. Новости анестезиологии и реаниматологии, 2005, 2, с. 1-17.
4. Белобородова Н.В., Бачинская Е.Н. Иммунологические аспекты послеоперационного сепсиса. Анестезиология и реаниматология, 2000, 1, с. 59-66.
5. Бережная Н.М.. Иммунологические исследования в клинике –состояние вопроса. Иммунология, 2006, 1, с. 18-23.
6. Бунятян К.А., Инвияева Е.В., Винницкий Л.И. Проблема нарушений иммунной регуляции в хирургической клинике (диагностика и лечение). Аллергология и иммунология, 2005, 6, 2, p. 143.
7. Винницкий Л.И., Бунятян К.А. Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация. Тезисы докладов Всерос.конф. М., 1995, с. 143-144.
8. Гусев Е.Ю., Юрченко Л.Н., Зотова Н.В., Копалова Ю.А. Критические состояния, качественные уровни системной воспалительной реакции.
9. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология.М., 2003,604 с.
10. Зильбер А.П. Этюды по медицине критических состояний, 287 с.
11. Зислин Б.Д., Скорняков С.Н. Синдром системной воспалительной реакции и метаболическая функция легких. Интенсивная терапия, 2006, 5,с.21-25.
12. Калинина Н.М., Сосюкин А.Е. с соавт. Травма: Воспаление и иммунитет. Цитокины и воспаление, 2005, т. 4, 1, с. 28-35.
13. Козлов В.К. Иммунопатогенез и цитокинотерапия хирургического сепсиса. 2002, 48 с.
14. Козлов В.К. Сепсис. СПб., 2006, 295 с.
15. Левит Д.А., Лейдерман И.Н., Малкова О.Г. Выраженность цитокинемии и расстройств белкового обмена у больных с абдоминальным сепсиcом.
16. Медуницын Н.В., Покровский В.И. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней. М., 2005, 525 с.
17. Назаров И.П. .Иммунодиагностика и иммунокоррекция при гнойно-септических состояниях. Х Сьезд Федерации анестезиологов и реаниматологов, 2006, СПб.
18. Нестерова И.В. Стратегия и тактика иммунотерапии вторичных иммунодефицитных состояний с инфекционным синдромом. Аллергология и иммунология, 2005, т.6, 2, с.302.
19. Руднов В.А. От локального воспаления к системному: выход на новые представления патогенеза критических состояний и перспективы терапии. Интенсивная терапия, 2006, 1(5), с.4-8.
20. Суханов В.А. Воспалительно-коагуляционный ответ как часть синдрома системной воспалительной реакции (SIRS). Интенсивная терапия, 2006, 1(5), с.46-48.
21. Abbas A.K.,Lichtman A.H. Les bases d'immunologie fondamentale et clinique. Elsevier SAS, 2005.
22. Bone R. Sepsis: A New Hypothesis for Pathogenesis of the Disease Process. Chest,1997,112, p.235-243.
23. Burmester G.R., Pezzutto A. Immunologie. Medecine-Sciences, 2005, 319 p.
24. Dwyer M.J., Ryan T. The cytoscore predicts survival in severe sepsis. 21-th ESICM Annual Congress, Lisbon, Portugal, 2008, p. 196.
25. Gabay C.,Smith M.F.,Eidlen D.,Arend W.P. Interleukin 1 Receptor Antagonist (IL-1Ra) is an acute-phase protein. Clin.Invest.,1997, vol.99, 12, p.2930-2940.
26. Frank J., Maier M, Koenig J., Rose S. et.al. Circulating inflammatory and metabolic parameters to Predict Organ Failure after Muliple Trauma. European J.of Trauma, 2002, vol. 28, N 6, p.333-339.
27. Fukao T., Matsuda S., Koyasu Sh. Synergistic effects of IL-4 and IL-18 on IL-12-dependent IFN-γ production by dendritic cells. The J. of Immunol., 1999, vol. 164, N 1, p. 64-72.
28. Lowry S.F.,Van Zee R.L., Rock C.S. et.al. Shock, sepsis and Organ failure: Third Wiggers Bernard Conference.Cytokine Network, Eds. G. Schlag et al. Berlin, 1993, p.3-17.
29. Mira J.-P.,Vallet B. Sepsis. Mechanismes immunitaires. Paris, 2004.
30. Pugin J. Dear SIRS, the concept of alarmins makes a lot of sense! Intensive Care Med., 2008, 34, p. 218-221.