Криоглобулины больных шизофренией как индукторы экспрессии фактора некроза опухоли-а лимфоцитами человека

Введение

Термин криоглобулинемия означает наличие в сыворотке крови комплексов, содержащих один (моноклональная криоглобулинемия) или несколько типов (смешанная криоглобулинемия) иммуноглобулинов (Иг), которые осаждаются при температуре ниже 37^оС и растворяются при нагревании [3,4,7,10]. Молекулярные механизмы генерации отмеченных аномальных иммунных комплексов или, так называемых, криоглобулинов (КГ) остаются невыясненными. В числе возможных причин может быть как изменение структурных характеристик моно- и поликлональных Иг-ов, так и характера взаимодействием отдельных компонентов в криокомплексе [4]. На основе состава и содержания белка КГ подразделяют на три типа. Тип I (›5мг/мл) состоит только из моноклональных Иг-ов, тип II (›1мг/мл) представляет собой смесь моноклональных и поликлональных Иг-ов, а тип III (‹ 1мг/мл) включает только поликлональные Иг [3]. Криоглобулинемия наблюдается при лимфопролиферативных, аутоиммунных и инфекционных заболеваниях и является неспецифическим маркером хронической активации иммунной системы, воспаления и аутоиммунной сенсибилизации [3,4,7]. КГ могут индуцировать развитие системного васкулита с преимущественным поражением мелких и средних артерий и вен в периферических органах [5]. Предполагают, что механизм, лежащий в основе повреждения тканей КГ-ми, по всей видимости, связан с отложением последних на стенках сосудов, что приводит к активации системы комплемента и развитию воспалительных реакций [5,7]. Однако экспериментальные данные, подтверждающие отмеченное предположение, практически отсутствуют. Имеется лишь одна работа, в которой показано, что КГ типа I имеют сильное активирующее воздействие на моно- нуклеарные клетки периферической крови (МНПК) [12]. Воздействие КГ-ов типа II и III на МНПК не было изучено. Ранее проведенные в нашей лаборатории исследования позволили выявить наличие КГ- ов типа III в крови больных шизофренией (ШЗ) [2]. Этот факт весьма интересен с учетом ключевой роли воспаления как на уровне ЦНС, так и на системном уровне, в этиопатогенезе шизофрении [1,9].

Исходя из вышеизложенного, цель настоящей работы состояла в оценке цитотоксичности КГ-ов, выделенных из крови больных ШЗ, по отношению к лимфоцитам человека и их способности к стимуляции продукции этими клетками медиатора воспаления - фактора некроза опухоли-а (ФНО-а).

Субъекты, материал и методы исследования

Субъектами исследования являлись 55 больных параноидной формой ШЗ (код DSM-IV-TR: F20.0) и 4 здоровых донора (2 женщины и 2 мужчин) без наследственной отягощенности ШЗ или другими психическими заболеваниями, которые были вовлечены в исследования. Пациенты (мужчины/женщины: 40/15; средний возраст (М±δ): 45,77±8,40 лет; средняя давность заболевание (М±δ): 17,36±9,21 лет; первая манифестация заболевания: 28,42±7,57 лет) принимали типические нейролептики, находились на лечении в Норкской клинике Психиатрического медицинского центра МЗ РА и были диагностированы в соответствии с критериями DSM-IV-TR [13] двумя независимыми психиаторами. Здоровые лица прошли предварительную психиатрическую проверку, подтвердившую отсутствие у них какого-либо психического заболевания или его наследственной отягощенности. Они не принимали каких-либо лекарственных препаратов как минимум за 1 месяц до начала исследования. Никто из субъектов исследования не страдал неврологическими, эндокринными, острыми или хроническими инфекционными, аутоиммунными, аутовоспалительными или онкологическими заболеваниями и не подвергался хирургическому вмешательству, как минимум за 12 месяцев до взятия крови. Все субъекты были проинформированы врачами о предстоящем исследовании и дали свое согласие на взятие крови. Исследование были одобрено Комитетом по этике Института молекулярной биологии НАН РА (IRB #00004079).

Забор крови проводили в 9:00-10:00 часов утра натощак пункцией из локтевой вены. Пробы крови сразу же помещали в термостат при 37^оС, затем центрифугировали при 3000g в течение 10 минут при 37^оС и отбирали сыворотку, которую использовали в последующих экспериментах. Выделение КГ из свежих образцов сыворотки крови проводили в соответ-ствии с ранее описанным методом [6,7]. Концентрацию КГ определяли по содержанию в них белка методом Lowry et al [11], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. Цитотоксичность КГ по отношению к лимфоцитам оценивалась при использовании 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 дифенилтетразолия бромистого (МТТ) в качестве индикатора жизнеспособности клеток методом (МТТ- анализ) Kasugai et al [8]. Выделение и культивирование лимфоцитов. Лимфоциты были получены из гепаринизированной крови здоровых доноров с использованием стандартного градиента плотности 

Рис. 1. Сравнение числа жизнеспособных лимфоцитов после инкубации различными концентрациями КГ-ов. а - время инкубации 24 часа; б - время инкубации 48часов.

фикола (Ficoll-Paque, Amersham Pharmacia Biotech). Лимфоциты культивировали при концентрации 106 клеток/мл в жидкой среде, включающей RPMI-1640 (Life Technologies, Великобритания), куда добавляли

Рис. 2. Концентрации ФНО-а в культуральной среде после инкубации лимфоцитов с КГ-ми, выделенными из крови больных ШЗ.

1% глутамин, 1% пенициллин-стрептомицин, 1% HEPES и 10% эмбриональную телячью сыворотку и инкубировали при 37^оC и 5% CO₂. Уровень ФНО-а был определен методом иммуноферментного анализа (ИФА), при использовании коммерческого набора соответствующих реактивов (“Вектор-Бест”, Россия), в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию выражали в пг/мл культуральной среды.

Статистический анализ данных был проведен с помощью программы «GraphPad Prism 3.03» software (GraphPad Software Inc, США) при использовании t-теста Стьюдента. Значения р‹0,05 были приняты как статистически достоверные.

Результаты

Чтобы проверить являются ли КГ цитотоксичными для лимфоцитов, в культуру этих клеток добавляли КГ (0,6-4,0мг/мл) и инкубировали в течение 24- ех и 48-и часов при температуре 37^оC. После инкубации проводился МТТ-анализ. Согласно полученным результатам, КГ больных ШЗ не проявляли цитотоксичного действия на клетки лимфоцитов человека в культуре (рис. 1).

Для выявления возможного стимулирующего воздействия КГ-ов на продукцию ФНО-а лимфоцитами, культивируемые клетки инкубировали с КГ- ами различных концентраций, в течение 24-ех и 48-и часов, после чего определяли уровень ФНО-а в культуральной среде с помощью ИФА. Как видно из данных, представленных на рисунке 2, начиная с концентрации КГ-ов 1мг/мл, наблюдается выраженная индукция экспрессии ФНО-а лимфоцитами. Максимально использованная нами концентрация КГ-ов составляла 4мг/мл, при которой продукция ФНО-а в 9 раз превышала таковую интактных культивируемых лимфоцитов (р‹0,05).

Обсуждение

КГ являются неспецифическими маркерами активации иммунной системы и развития воспалительных реакций. Полученные нами результаты показали, что КГ не являются цитотоксичными для лимфоцитов человека, однако их накопление в кровотоке и отложение в тканях (например, на сосудистом эндотелиуме) могут стимулировать экспрессию провоспалительного цитокина, ФНО-а. Принимая во внимание ключевую роль ФНО-а в воспалительном ответе, мы пришли к выводу, что КГ могут способствовать развитию воспалительных процессов, характерных для патогенеза ШЗ и, таким образом, вносить свой вклад в нарушения иммунного статуса организма, наблюдаемые при данной патологии.

Выводы

1. КГ типа III, выделенные из крови больных ШЗ- ей, в концентрации ≤ 4мг/мл не цитотоксичны для лимфоцитов человека.
2. КГ типа III, выделенные из крови больных ШЗ- ей, индуцируют экспрессию ФНО-а лимфоцитами человека при концентрации ≥1мг/мл.
3. КГ типа III, могут быть ответственны за развитие воспалительных реакций и нарушение иммунного статуса организма при ШЗ.

Благодарность

Работа выполнена при поддержке гранта Национального фонда науки и передовых технологий РА (#ECSP-10-01_GRSP).

Список литературы

1. Хоецян А.Г., Бояджян А.С. Роль аномалий развития мозга в патогенезе шизофрении. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова (Москва), 2010, 110 (2), 97-101.
2. Boyajyan, A., et al. Cryoglobulins as indicators of upregulated immune response in schizophrenia. Clin Biochem, 2008. 41(6): p. 355-60.
3. Brouet, J.C., et al. Biologic and clinical significance of cryoglobulins. A report of 86 cases. Am J Med, 1974. 57(5): p. 775-88.
4. Ferri, C., A.L. Zignego, and S.A. Pileri. Cryoglobulins. J Clin Pathol, 2002. 55(1): p. 4-13.
5. Ferri, C. and M.T. Mascia. Cryoglobulinemic vasculitis. Curr Opin Rheumatol, 2006. 18(1): p. 54-63.
6. Hardin et al. Cryoprecipitogogue from normal serum: mechanism for cryoprecipitation of immune complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Jul;78(7):4562-5.
7. Kallemuchikkal, U. and PD. Gorevic Evaluation of cryoglobulins. Arch Pathol Lab Med, 1999. 123(2): p. 119-25.
8. Kasugai S, Hasegawa N, Ogura H. A simple in vito cytotoxicity test using the MTT (3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) colorimetric assay: analysis of eugenol toxicity on dental pulp cells (RPC-C2A). Jpn J Pharmacol. 1990 Jan;52(1):95-100.
9. Khoyetsyan A., Boyajyan A. Chapter X. The prospective epigenetic keys for the inflammatory puzzle of schizophrenia. In: Schizophrenia Research: Recent Advances (Editor: T. Sumiyoshi), Nova Science Publishers Inc., USA, 2012, pp.1-70.
10. Lospalluto, J., et al. Cryoglobulinemia based on interaction between a gamma macroglobulin and 7S gamma globulin. Am J Med, 1962. 32: p. 142-7.
11. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov;193(1):265-75.
12. Mathsson, L., et al. Cryoglobulin-induced cytokine production via FcgammaRIIa: inverse effects of complement blockade on the production of TNF-alpha and IL-10. Implications for the growth of malignant B-cell clones. Br J Haematol, 2005. 129(6): p. 830-8.
13. Diagnostic and statistical manual of mental disorders by the American Psychiatric Association. 4th ed., text revised. USA (Amer. Psychiatric Pub.), 2000, -943pp.

Вопросы, ответы, комментарии