Уровень и активности фракции экстрацеллюлярной NADPH оксидазы из асцитной карциномы яичника женшин на различных стадиях заболевания

Впервые экстрацеллюлярная NADPH оксидаза (еNох) или цитохром b₅₅₈ была выделена из сыворотки плацентарной крови женщин с использованием ионообменной хроматографии на целлюлозах КМ-52, ДЕ-52 и сефадексе ДЕАЕ А-50 [6]. еNох была выделена из сыворотки крови млекопитающих [1,2] при различных типах злокачественных новообразований (лимфобластический и миелобластиче- ский лейкозы человека, саркома-45 крыс), при хронической кадмиевой интоксикации крыс [3], при сердечно-сосудистых заболеваниях у человека [4], а также при аэробном инкубировании крови млекопитающих [5]. При этих патологических состояниях обобщенной чертой является снижение стабильности эритроцитов. NADPH- оксидазная активность обнаружена в сыворотке крови. При этом в самой сыворотке крови носителя злокачественного новообразования активность NADPH -оксидазы существенно повышена по сравнению с сывороткой здорового человека [7-9]. Для нейтрализации супероксидов, продуцируемых экстрацеллюлярной NADPH -оксидазой, существует экстрацеллюлярная СОД, играющая антивоспалительную роль, особенно, при заболеваниях легких различного характера [10-12]. С другой стороны, антиоксидантный потенциал в опухолевых клетках яичника метастатического характера существенно повышен, с увеличением их способности прилипания и агрессивности [13-15]. Однако, в настоящее время данных о наличии еNох в жидкости асцитной карциномы яичника женщин отсутствуют.

Выделение фракции еКох из жидкости асцитной карциномы яичника женщин на различных этапах болезни, а также определение свойств этой КЛБРН-оксидазы являлось целью исследования.

Материал и методы. Жидкость асцитной карциномы яичника женщин (по шесть больных, 46-55 лет), с давностью заболевания 1,2 и 3,5 года была доставлена из онкологического диспансера г. Гюмри.

Выделение фракции в Nох из жидкости асцитной карциномы яичника женщин. Фракции еNох из жидкости асцитной карциномы (ЖАК) яичника женщин (по 20мл), с давностью заболевания 1,2 и 3,5г, а также из сыворотки донорской крови (СДК) были получены разработанным нами способом [16]. Следы эритроцитов и плазменных клеток из ЖАК и СДК были удалены путем их центрифугирования при 14000об/мин, 15мин. Супернатанты (они имели слаборозовый цвет у пациентов с давностью заболевания 1,2 года и темно красный цвет, с давностью заболевания 3,5 года) инкубировали в аэробных условиях в течение 4 суток при 4о. После их центрифугирования в приведенных условиях и разбавления водой (20-25раз) фракции экстрацеллюлярной КЛБРН оксидазы из ЖАК и СДК выделяли ионобменной хроматографией надосадочного раствора на сефадексе ДЕАЕ А-50 с последующим элюированием 0,04М калий фосфатным буфером КФБ. После вторичного разбавления элюата водой (10раз) и ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЕ-52, фракцию еNох из ЖАК и СДК элюировали 0,04 М КФБ.

Определение NADPH зависимой О₂^- продуцирующей активности eNох из ЖАК и СДК. NADPH зависимую О₂ ^-продуцирующую активность еNох определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента образующегося формазана при 560нм в результате восстановления НТС супероксидными радикалами [17]. За единицу КАДРН зависимой О2 -продуцирующей активности изоформ еКох принимали количество белка (плотность оптического поглощения β-полосы при 530нм), которое стимулирует образование формазана на 50%. Удельная КЛБРН зависимая О2 - продуцирующая активность еКох была определена в расчете на 1мл ЖАК и 1мл сыворотки СДК.

Определение ферригемоглобин-восстанавливающей активности вЫох из ЖАК и СДК. Ферригемоглобин (ферриНb-восстанавливающую активность еNох из ЖАК и СДК определяли используя свежеполученный ферриНb цитоплазмы эритроцитов человека с величиной плотности оптического поглощения (а полоса поглощения) при А₅₆₅= 0,6 оптических единиц). Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра, к 3мл раствора ферриНb добавляли 0,2мл NADPH оксидаз с А₅₃₀=0,2 оптических единиц. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16ч при 30^о. Далее, после повторного перемешивания реакционной смеси определяли кинетику восстановления ферриНЬ до ферроНЬ, путем измерения снижения плотности а полосы поглощения ферриНb при 565нм (это снижение прямо пропорционально образующемуся ферроНb при А₅₅₅). За единицу ферриНb-восстанавливающей активности NADPH оксидазы принимали количество белка, вызывающего снижение плотности максимального оптического поглощения а-полосы ферриНЬ величиной до 0,05 оптических единиц в течение часа при 20^о. Удельная ферриНb-восстанавливающая активность изоформы NADPH оксидазы была определена в расчете на 1мл ЖАК или 1мл СДК [18].

Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре “Specord UV/VIS” (Германия), с длиной оптического пути 1см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности «р».

Результаты и обсуждение

С использованием ионобменной хроматографии на целлюлозе ДЕ-52 и сефадексе ДЕАЕ А-50 впервые выделена фракция еКох из ЖАК яичника женщин. Из 20мл ЖАК яичника женщин получается по 10мл фракция еNох с выходом до 68% и плотностью опти-ческого поглощения при 530 нм (β-полоса поглощения) равной 0,58 (со сроком давности болезни -3,5 года) и 0,4 оптической единицы (со сроком давности 1,2 года). Этот показатель для донорской крови составляет 0,15 оптической единицы (рис.1). Эти еNох имеют характерные для NADPH оксидаз оптические спектральные показатели. В окисленном состоянии в видимой области спектра, наряду с максимумами оптического поглощения при 560, 530, 412нм, имеется и характерное для еКох сыворотки донорской крови оптическое поглощение при 485нм, а в восстановленном состоянии: при 558, 525 и 418нм (рис.1). По форме оптических спектров еNох из ЖАК яичника женщин не отличается от еКох из СДК. Однако, удельное содержание еКох из ЖАК (плотность максимального оптического поглощения β-полосы при 530мн) выше таковой у еКох из СДК в 3,8+/-0,2 раз (р‹0,05) и в 2,6+/-0,3 раз (р‹0,05), при давности заболевания 3,5 и 1,2 года соответственно.

Рис. 1.Оптические спектры поглощения экстрацеллюлярной NADPH оксидазы в окисленном состоянии: а - из асцитной карциномы яичника женщин с давностью заболевания 3,5г (1), и 1,2г (2) и из сыворотки донорской крови (3). б - после разбавления этих еNox 0,1 М калий фосфатным буфером (1) и их восстановления дитионитом натрия (2)

По сравнению с еКох из СДК NADPH зависимая О₂^--продуцирующая активность еNох из ЖАК яичника женщин увеличена на 10,4±1,3% (р‹0,03) и 16,3+/-2,5% (р‹0,03) при давности заболевания 1,2 и 3,5года соответственно (рис.2-а). Однако, по сравнению с еNох из СДК ферриИb-восстанавливающая активность еNох из ЖАК снижена на 14,1+/-1.1% (р‹0,05) и 22,3+/-2,0% (р‹0,02) при давности заболевания 1,2 и 3,5 года соответственно (рис.2-б) Снижение ферриИb-восстанавливающей активности у еКох из ЖАК, особенно с давностью заболевания 3,5года свидетельствует об определенном ослаблении кислородного гомеостаза [19] в ЖАК яичника женщин (ферриИЬ не способны перенести молекулярный кислород к клеткам). При этом факт слабого покраснения жидкостной среды карциномы яичника с давностью заболевания 1,2 года и существенное увеличение этой окраски с давностью заболевания 3,5 года свидетельствуют о том, что при накоплении этой жидкости в яичнике женщин происходит на фоне существенного снижения стабильности эритроцитов, с увеличением степени гемолиза эритроцитов. Механизм формирования еКох пока не определен, однако это наблюдается при таких патологических состояниях, когда имеет место снижение стабильности эритроцитов в результате перекисно- го окисления ненасыщенных жирных кислот эритро- цитарных мембран (повышение текучести эритроцитов) активными формами кислорода, уровень которых резко увеличивается при канцерогенезе [20-22]. Фактически для роста опуголевых клеток определенную роль имеют не только интрацеллюлярные, но и экстрацеллюлярные О₂ , продуцируемые еNох в ЖАК яичника. По предварительным результатам еКох формируется и в жидкости асцитной карциномы Эрлиха у мышей, в жидкости асцитной карциномы легких человека, и ее содержание увеличивается также со снижением стабильности эритроцитов. При этом удельное содержание еNох из асцитной карциномы Эрлиха у мышей выше таковой у еNох из ЖАК яичника женщин около 4 раз.

Рис. 2. NADPH зависимая О₂¯-продуцирующая и ферригемоглобин-восстанавливающая активности экстрацеллюлярной eNox. а – NADPH зависимая О₂¯ -продицирующая активность eNox из сыворотки донорской крови (1), из ЖАК яичника женщин с сроком давности на 1,2 г (2) и 3,5 г (3) б – ферриHb–восстанавливающая активность eNox из сыворотки донорской крови (1)., из ЖАК яичника женщин с сроком давности на 1,2 г (2), и 3,5 г (3)

Можно заключить, что в жидкости ЖАК яичника женщин также образуется еNох и, в зависимости от давности заболевания (1,2 и 3,5 года), уровень и NADPH- зависимая супероксид-продуцирующая активность формированной еКох повышаются, наоборот ферриНb-восстанавливающая активность этой еNох снижается. Возможно, введением в жидкостной среде карциномы антиоксиданта (для снижения уровня О₂^- ) или, наоборот, прооксидантасупрола (супероксид-продуцирующего липопротеина сыворотки крови [23]), для увеличения уровня супероксидов можно изменить окислительно-восстановительный статус [24] опухолевых клеток ЖАК яичника, вызывая гибель этих клеток.

Список литературы

1. Симонян Г.М.. Мед.наука Армении, 2002, XLII(2): 101-103.
2. Симонян Г.М., Нерсесян А.К., Симонян Р.М., Бабаян М. А., Симонян М. А., Галоян А. А. Нейрохимия, 2005, 22(2): 125-130.
3. Сираканян М.С., Симонян Г.М., Бабаян М.А., Симонян М.А. Вестник МАНЭБ Санкт-Петербурга, 2006, 11(8): 192-197.
4. Алексанян Серг.С., Степанян А.А., Симонян М.А. Вестник МАНЭБ Санкт-Петербурга, 2004, 8 (7): 164167.
5. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Мед.наука Армении, 2005, XLV(2):26-29.
6. Simonyan M.A., Babayan M.A., Simonyan G.M. Biochemistry (Moscow), 1995, 60(12): 1509-1516.
7. Theron A.J., Steenkamp K.J., Anderson R. Inflammation,1994,18(5): 459-467.
8. Berridge M.V, Tan A.S. Antiox.Redox Signal, 2000, 2(2):231-242.
9. Ligeti E., Tardif M., Vignais P.V. Biochemistry, 1999, 22(17): 7116-7123.
10. Folz R.J., Abushamaa A.M., Suliman H.B. J.Clin.Invest, 1999, 103(7): 1055-1066.
11. Tsan M.F. Int.J.Mol.Med., 2001, 7(1): 13-19.
12. Bowler R.P., Nicke M., Tran K. et al., Am.J. Respir.Cell Mol.Biol., 2004, 31(4): 432-439.
13. Wang Y., Dong L., Cui H., Shen D.H. et al., J.Zhejilang Univ.Sci.B., 2011,12(5):346-356.
14. Golombick T., Bezwoda W.R. Eur.J.Cell Biol., 1991, 56(2): 459-463.
15. Yang W., Toffa S.E., Lohn J.W., Seifalian A.H., Winslet M.C. Gynecol.Oncol., 2005, 96(2): 430-438.
16. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Способ получениия металлопротеинов крови. Лицензия изобрет.Армпатента, N 341. Ереван, 1997.
17. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Симонян М.А., Галоян А.А. Мед. наука. Армении, 2003, XLIII(1), 30-34.
18. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. Electronic J. Natural Sci. NAS RA, 2006, 2(7), 3-6.
19. Della R.F., Granata A., Braccio M. et al. Anticancer Res.,1995,15: 2089-209.
20. Liu P., Shen H., Zhang W. Di-San Junyi Daxue Xuebao, 1997, 19(4): 366-368.
21. Kkoev V.R. Biochim.Biophys.Acta, 1990, 137(2): 284294.
22. Girotti A.W., Thomas J.P., Jordan J.E. Arch.Biochem.Bio- phys., 1985, 236(1): 238-251.
23. Симонян М.А., Карапетян А.В., Галстян Д. А., Симонян Р.М., Бабаян М.А. Биохимия, 1996, 61(9): 1578-1583.
24. Gius D., Spitz D.R. Antioxid. Redox. Signal, 2006 (7- 8):1249-1252.

Вопросы, ответы, комментарии