Экспериментальное обоснование применения ксеногенного деминерализованного костного матрикса в комбинации с насыщенной тромбоцитами плазмой

Близким аналогом фетальной аллогенной костной ткани по структурной организации является костная ткань новорожденный животных. Незрелая костная ткань новорожденных животных так же, как и фетальная кость, содержит большое количество факторов роста (в частности, TGF-p, FGF и BMPs [4,5] и имеет сходное строение и биохимический состав. Учитывая это, а также ограниченную доступность фетальной аллокости, нативная незрелая костная ткань новорожденных животных (например, незрелая костная ткань новорожденных свиней) может быть источником получения материала для стимуляции репаративной костной регенерации. В то же время, клиническое применение незрелой костной ткани новорожденных животных (в деминерализованной форме), по данным литературы, отмечено в единичных случаях [1,2,6]. Стимулирующее действие незрелой костной ткани новорожденных животных, очевидно, связано с наличием в ее составе факторов роста в количестве, сопоставимом с фетальной костной тканью, относительно легкой резорбцией (более быстрой, чем у алло). Биоматериалы животного происхождения являются перспективными для их внедрения в широкую клиническую практику ввиду таких преимуществ, как возможность забора неограниченного количества донорского материала, удобства в плане инфекционного контроля, степени содержания факторов костной индукции, экономическая выгодность.

Исследования последних лет доказали положительную роль БоТП в восстановлении и регенерации кости и мягких тканей, а также и значительно более быстрому созреванию ткани и образованию плотной трабекулярной кости. В результате многочисленных экспериментальных исследований было выявлено большое преимущество влияния БоТП на репаративную регенерацию костной ткани [3,8]. Однако, в литературе, в ряде экспериментальных исследований встречаются противоречивые данные, связанные в комбинированном использовании БоТП с костнопластическими материалами [7].

Целью данной работы является изучение осо-бенностей репаративной регенерации костной ткани с применением комбинации деминерализованного костного матрикса с богатой тромбоцитами плазмой крови в эксперименте.

Материал и методы исследования

Опыты проводились на 44 половозрелых кроликах калифорнийской породы, со средней массой 4.2 кг, которые содержались в условиях вивария на стандартном пищевом рационе. Животные были разделены на следующие группы: 1-(контрольная) без замещения дефекта каким-либо костно-пластическим материалом, П-(контрольная) с замещением дефекта ДКМнп., Ш-(основная) с замещением дефекта ДКМнп с БоТП. В первую группу входили два кролика, а во вторую и третью- по 21 кролику. Операция проводилась под общим обезболиванием с применением инъекционного успокаиваящего средства -2% р-ра “Рометар” с болеутоляющим и миорелак- сационным действием для применения в ветеринарии. Препарат вводили внутримышечно в дозировке 0.1мл/1кг.ж.м. Вмешательство начинали после наступления наркотического сна. В зоне оперативного вмешательства проводили инфильтрационное обезболивание 0.5% р-ром лидокаина гидрохлорида в количестве 4-5мл. После проводился разрез кожи, огибающий угол нижней челюсти кролика длиной 3.5-4см. Мягкие ткани иссекались послойно до кости. После скелетирования кости угла нижней челюсти проводилась ее трепанация 10мм трепаном, с образованием сквозного дефекта, который в зависимости от групп заполнялся костно-пластическим материалом или не заполнялся вообще. Рана ушивалась наглухо непрерывным швом. Швы удалялись на 7-е послеоперационные сутки.

Для заготовки ДКМнп у новорожденных поросят забирались трубчатые кости, которые подвергались механической обработке и обезжириванию в эфире. Далее проводилась деминерализация в 1.2К растворе НС1, стерилизация в 0,25% растворе нашатырного спирта в течение 30 минут, хранение в морозильной камере бытового холодильника при температуре- 12^oС. Трансплантаты подвергались бактериологическому контролю и использовались в эксперименте не ранее 14 дней после заготовки. Забор крови для получения БоТП выполнялся из ушной вены кролика в количестве 4-5мл в заранее подготовленный шприц, содержащий 0.8мл антикоагулянта и переливалась в пробирку. Далее кровь, смешанная с антикоагулянтом центрифугировалась в течение 10мин со скоростью 3000об/мин. В результате в пробирке наблюдалось оседание эритроцитов на дно, а верхний слой составляла плазма крови. Отделенная плазма переливалась в другую пробирку и центрифугировалась повторно в течение 15мин, со скоростью 4000об/мин., в результате чего происходила сепарация богатой тромбоцитами плазмы, которая оседала на дне, от бедной, которая шприцем забиралась из пробирки. Оставшуюся на дне БоТП смешивали с размельченным ДКМнп и добавляли 5 капель 10% СаС1₂ на 1мл плазмы, а также 5000ед. бычьего тромбина для иницирования каскада свертывания. Через несеолько минут БоТП принимает гелеобразное состояние, что облегчает работу с ним. Кролики выводились из эксперимента на 7, 21, 30, 60 и 90-ые послеоперационные сутки методом

Рис.1. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп на 14 послеоперационные сутки (окраска гематоксилин- эозином): а) 1х60, б) 1х200

воздушной эмболии. Фрагменты угла нижней челюсти забирались в виде блоков для дальнейшего рент-генологического, радиовизиографического и гистоло-гического обследований.

Результаты и обсуждение

Смоделированный циркулярный костный дефект УНЧ размером 10мм у животных 1-ой группы спонтанно не регенерировал и к 6-и мес. сроку на-блюдения оставался замещенным лишь соединительной тканью. Края дефекта к концу эксперимента несколько видоизменились, от периферии к центру отходили разряженные тени новообразованного костного ободка. Размер костного дефекта незначительно

Рис.2. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп на 21 послеоперационные сутки (окраска гематоксилин- эозином): а) 1х30, б) 1х200

(около 1мм) уменьшался. Эта группа животных была принята за контрольную, для сравнения с результатами исследований с замещением созданного дефекта угла нижней челюсти кролика костно-пластическими материалами.

Во второй группе животных на 14-е послеоперационные сутки, по гистограммам, окрашенным гематоксилин-эозином, со стороны материнской кости очевидны активные пролиферационные процессы, расширение гаверсовых каналов, утончение кор-тикального слоя. Перестройка трансплантационного материала в компактную кость с формированными костными трабекулами и перемычками грубоволокнистой соединительной ткани между кусочками  трансплантата (рис. 1). 

Рис.3. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп 1х60: а) на 30, б)на 60, в)на 90, г)на 180-е послеоперационные сутки

В дальнейшем, на 21-30-е сутки кусочки ДКМнп оказываются замурованными в рыхлой соединительной ткани, в которой превалируют процессы гомогенизации остеона. Со стороны материнской кости продолжается пазушное рассасывание, в ходе которой образуются продольно расположенные обызвестленные костные балочки с широкими и пустыми гаверсовыми каналами. Присутствие в препаратах лимфоидных и лейкоцитарных инфильтратов говорит о превалировании процессов рассасывания (рис. 2).

Истинные процессы перестройки трансплантационного материала с очевидным преимуществом заместительных процессов начинают выявляться на 30-60-ые сутки (рис. 3а,б). На эти сроки перестройка ДКМнп приводит к формированию новообразованной пластинчатой кости, преимущественно в периферических зонах трансплантата, в сочетании с фиброзно-рубцовой тканью, занимающей межбалочковые пространства. На 90-е послеоперационные сутки смоделированный костный дефект замещен смесью костных и грубоволокнистых структур (рис. 3в).

В гистограмме представлена картина незаконченного остеогенеза, который завершается на 180-е сутки.

К этому сроку дефект оказывается замещенным костной тканью различной степени зрелости, без формирования кортикального и губчатого слоев костной ткани, соответствующей данному сегменту костной ткани (рис. 3г). Итак, во второй группе животных к 6-ти месячному сроку наблюдений гистологические исследования показали, что заполнение ДКМнп костного дефекта УНЧ не привело к образованию органотипичной кости, тем не менее дефект был замещен костной тканью.

В третьей группе животных (с заполнением дефекта ДКМнп+БоТП) на сроках 7 дней гистограммы окрашенных гематоксилин-эозином препаратов показывают наличие камбиальных клеток с фибриновой сетью, наслоенных на костный матрикс. Обнаруживаются начальные процессы дегрануляции тромбоцитов, вовлечение макрофагов, реактивный воспалительный фон, признаки резорбции ДКМнп с разволокнением коллагеновых волокон, пролиферация фибробластоподобных клеток с образованием местами упорядоченной фиброзной ткани с элементами ангиогенеза, местами глыбчатого скопления основного вещества костного матрикса (КМ). Уже на 7-е послеоперационные сутки отмечаются форсированные процессы регенеративного фона различной степени выраженности на всем протяжении дефекта: 1) в центральных участкам КМ в процессе резорбции с образованием синусных полостей, обволокненный и пронизанный густой сетью фибробластических клеток, которые в отдельных от КМ участках организовывали оформленную фибробластическую ткань с капиллярными сосудами;  

Рис.4. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп+БоТП на 7-е послеоперационные сутки (окраска гематоксилин- эозином): а) 1х60, б) 1х200

2) ближе к центру дефекта менее зрелая фи-брозная ткань и КМ в начальной стадии рассасывания; 3) к ложу дефекта прилегает ткань со смесью мышечных волокон, камбиальных клеток и пролиферирующих фибробластоподобных клеток (рис. 4а, б).

На срок 14 дней наблюдается частичное затихание реактивных процессов. Окраска гематоксилин- эозином отображает картину оформления фиброзной ткани с хондрогенезом и оформленными сосудами капиллярного типа с участками полостей синусоидного типа, примыкающих к зоне пролиферирующей мышечной ткани по периферии и по всему диаметру препарата (рис. 5а,б).

На срок 21 день процессы реорганизации костного трансплантата и новообразованной костной ткани продолжаются с признаками молодого регенерата. По периферии формирование пластинчатой кости без четкой архитектоники, в центральных участках процессы замещения и формирование регенерата все еще с расширенными сосудистыми каналами. Кайма формирующейся пластинчатой кости с мышечными волокнами врастает вглубь в виде новообразованных примитивных костных балочек. Однако слияния границ дефекта и созревающего регенерати пока нет. Имеется обилие костных каналов, забитых грануляционной ретикулярной тканью. В итоге, весь препарат состоит из различных участков ткани, находящихся в разных стадиях дифференцировки с преобладанием заместительных процессов (рис. 6).

На срок 30 дней препараты, окрашенные гематоксилин-эозином представлены единой-разно- дифференцированной грубоволокнистой соединительной тканью. По периферии молодая пластинчатая кость, повсеместно примитивные костные балочки 

Рис.5. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп+БоТП на 14-е послеоперационные сутки (окраска гематоксилин-эозином): а) 1х30, б) 1х200

Рис. 6. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп+БоТП на 21-е послеоперационные сутки (окраска гематоксилин- эозином) 1х60

с расширенными гаверсовыми каналами и элементами костного мозга и не полноценно сформированным гемопоясом. Ближе к центру наблюдаются продольное выстраивание примитивных, обызвестленных балочек с широкими и увеличенными гаверсовыми каналами с остатками элементов костного мозга. Центральные участки представлены новообразованными костными балочками, построенными в виде губчатой кости (рис.7).

На срок 60 дней процессы формирования реге-нерата продолжаются. Отмечаются участки сформированной новообразованной пластинчатой кости и зоны малодифференцированной новообразованной кости с широкими гаверсовыми каналами. Вглубь препарата образуются выросты из слабоизвестленных остеонных балочек с широкими безбалочковыми пространствами, иммитирующую разряженную губчатую ткань, которая внедряется в грубоволокнистую соединительную ткань с островками хондрогенеза и пролиферирующими фибробластами, диффузно рас-положенными остеобластами, сосудами капиллярного типа. Однако, на этот срок прослеживается целостность регенерата в виде пластинчатой кости различной степени зрелости, перемежающиеся с грубоволокнистой соединительной тканью, с энхондральным остеогенезом (рис. 8).

На срок 90 дней препараты, окрашенные гематоксилин-эозином выявляют значительные участки новообразованной кости. Хотя по периферии еще сохраняется сеть грубоволокнистой соединительной ткани с пучками мышечных волокон, далее организо-ванная фиброзная ткань с участками энхондрального окостенения, обрывки молодой пластинчатой кости с расширенными гаверсовыми каналами. Зоны с сформированными костными каналами и перифери-ческие участки с пластинчатой костью. Общая картина отображается структурой новообразованной костной ткани (рис.9).

К 180-ым послеоперационным суткам регенерат был представлен зрелой пластинчатой костью и участками схожих по архитектонике со спонгиозным компонентом костей нижней челюсти. Целостность дефекта была восстановленна на всем протяжении костной тканью, близкой к органотипичной (рис.10).

Таким образом, стимулирование остеогенных свойств ДКМнп БоТП-ой позволило активировать процессы репаративной регенерации в данном сегменте, восполнив спонтанно не регенерирующий дефект зрелой костной тканью. Обобщая полученные результаты экспериментов, становится очевидным, что наиболее эффективным материалом, способным вызвать образование органотипичной костной ткани в наиболее оптимальные сроки, является комбиниро-ванный материал, состоящий из деминерализованного костного матрикса новорожденных поросят и богатой тромбоцитами плазмы. Полученный результат является следствием совместного действия свойств ДКМ, как материала способного вызвать индукцию костеобразования, эффективность которого возрастает при воздействии БоТП.

Рис. 7. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп+БоТП на 30-е послеоперационные сутки (окраска гематоксилин- эозином): а) 1х60, б)1х200

Рис. 8. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп+БоТП на 60-е послеоперационные сутки: а) 1х60, б)1х200

Рис. 9. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп+БоТП на 90-е послеоперационные сутки: а) 1х60, б)1х200

Рис. 10. Дефект УНЧ кролика, заполненный ДКМнп+БоТП на 180-е послеоперационные сутки: а) 1х30, б)1х200

Список литературы

1. Аветисян С.С. Применение костно-матричных трансплантатов в сочетании с антибактериальными средствами в хирургической стоматологии. Авт. дисс. канд.мед. наук. Ереван, 2008. 21с.
2. Арутюнян А.А. Экспериментально-клиническое обоснование применения насыщенной тромбоцитами плазмы при ксенотрансплантации дефектов.
3. Cheng X, Lei D, Mao T, Yang S, Chen F, Wu W. Ulus Travma Acil Gerrahi Derg. 2008 Apr; 14(2): 84-95.
4. Cohn M.J., Izpisua-Belmonte J.C., Abud H., Heath J.K.,Tickle C. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the fl ank of chick embryos, Cell, 1995,v.80, p.739-746.
5. Einhorn T. Enhancement of fracture-healing. J. Bone Joint Surg. [Am], 1995, v.77, p.940-956.
6. Iwata M., Nishijima K. Experimental study of two-step grafting of fetal bone: comparison with newborn and infl uence of MHC, Transplant. Proc., 1994 April 26(2),p.959-962.
7. Jung RE, Glauser R, Schärer P, Hämmerle CH, Sailer HF,Weber FE. Effect of rhBMP-2 on guided bone regeneration in humans. Clin Oral Implants Res. 2003 Oct;14(5):556-68.
8. Simonpieri A, Del Corso M, Vervelle A, Jimbo R,Inchingolo F, Sammartino G, Dohan Ehrenfest DM Current Knowledge and Perspectives for the Use of Platelet-Rich Plasma (PRP) and Platelet-Rich Fibrin (PRF) in Oral and Maxillofacial Surgery. Part 2: Bone Graft, Implant and Reconstructive Surgery Curr Pharm Biotechnol. 2011 Jul 8 [Epub ahead of print].

Вопросы, ответы, комментарии