Необратимое снижние преднизолоном уровня и активности клбри оксидаз в гомогенной и гетерогенной фазах

Преднизолон (ПН) в большинстве случаев подавляет активность супероксид (О2)- продуцирующих систем при различных патологических состояниях. При аутоиммунных, ревматических заболеваниях ПН подавляет О₂^- продуцирующую активность NADPH оксидазы, приближая ее к норме [7]. С другой стороны, как потенциальный противовоспалительный препарат, ПН неэффективен в случае дыхательной недостаточности, при которой стимулируется продуцирование О₂^-, (последние, воздействуя с NO, образуют высокотоксичные иминопероксильные радикалы). При инкубировании ПН и ФНО-алфа с эндотелиальными клетками дыхательной артерии свиней в течение 16ч наблюдается существенное увеличение продуцирования О₂^- и экспрессии gp 91 phox NADPH оксидазы и нитрит оксид синтазы, однако не влияет на ход продуцирования О₂^- клетками гладких мышц [8]. ПН (10мкмоль) и дексаметазон подавляют продуцирование О₂^- тромбоцитами человека, проявляя антивоспалительный эффект [10]. При гипертензии и атеросклерозе ПН и дексаметазон также подавляют процесс продуцирования О₂^- клетками сосудов гладких мышц в культуре клеток [6]. Ок- сидативное поврвждение клеток сосудов активными формами кислорода (АФК), продуцируемыми активированными фагоцитами, имеет место при артрите (воспаление сосудов). При этом наблюдается повышение уровня АФК в 2-8 раз, а ПН подавляет О2- продуцирующую активность NADPH оксидазы моноцитов и нейтрофилов, приближая ее к норме [7]. В эксперименте введенный крысам вместе с питьевой водой метилпреднизолон (0,15мг/кг) в течение 48ч также вызывает концентрационно-зависимое подавление продуцирования О₂^- моноцитами и макрофагами [9]. Таким образом, при различных заболеваниях ПН, в подавляющем большинстве случаев, снижает О₂^-продуцирующую активность NADPH оксидаз. Однако молекулярно-биохимические механизмы действия ПН на эти ферменты (или причины инак- тивирования NADPH оксидаз) недостаточно выяснены. Определение этих механизнов на оптическом спектральном уровне in vitro и ex vivo являлось целью работы.

Материал и методы

Выделение и очистка изоформ NADPH оксидазы или цитохрома b558 из мембран и ядер клеток селезенки, а также из мембран клеток костного мозга крыс. NADPH оксидазы (Nox) из мембран клеток селезенки (МКС), ядер клеток селезенки (ЯКС) и мембран клеток костного мозга (МККМ) выделяли и очищали без использования детергента для солюбилизации указанных гемопротеинов (использовали 30г ткани селезенки). После промывания селезенки и костного мозга физиологическим раствором и взвешивания, гомогенизацию тканей проводили в 0,25М сахарозе (1г ткани в 10мл сахарозы) стеклянным го-могенизатором с тефлоновым пестиком в течение 1мин при 4о. Ядра клеток осаждали центрифугированием гомогената при 3000 об/мин, в течение 10мин. После осаждения митохондрий из супернатанта центрифугированием 14000 об/мин, 15мин, осадок МКС и МККМ собирали центрифугированием при рН 5,6 в течение 15 мин [2]. Осадки ЯКС, МКС и МККМ промывали водой (1:50об/об) и центрифугировали в аналогичных условиях. Очищенные от следов сахарозы и других сопутствующих водорастворимых солей МКС, ЯКС и МККМ далее смешивали с водой (1:5об/об) и повторно гомогенизировали в аналогичном режиме. После солюбилизации изоформ Кох из очищенных МКС, ЯКС и МККМ и центрифугирования, супернатанты подвергали ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой КМ-52 (для удаления следов сопутствующих белков основного характера). Не задерживающиеся на колонке с КМ-52 белковые фракции далее подвергали ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЕ-52.После промывания колонки сначала водой, а затем 0,01М калий фосфатным буфером рН 7,4 (КФБ), изоформы Кох кислой природы из МККМ, ЯКС и МКС из колонки ДЕ-52 элюировали 0,2М КФБ. После гель-фильтрации этих Кох на колонке с сефадек- сом 0100, центральная фракция имела электрофоре- тически гомогенное состояние [3].

Выделение и очистка изоформы Nox из эритроцитарных мембран. Фракцию Кох из эритроцитар- ных мембран (ЭМ) выделяли путем ее солюбилизации из ЭМ (последние выделяли из 30мл эритроцитов крови крыс), диализа против воды, центрифугирования и ионообменной хроматографии супер- натанта на колонках с целлюлозой КМ-52 и ББ-52, а также гель-фильтрации на колонке с сефадексом 0100 [7]. В результате этого из ЭМ получали электрофоретически гомогенный препарат Кох кислой природы.

Выделение и очистка изоформы экстрацеллолярный Nox (eNox) из сыворотки крови крыс. После инкубирования очищенной от следов эритроцитов и клеток плазмы сыворотки в течение 4 суток при 4^оС ее подвергали диализу против воды. После центрифугирования диализата (12000 об/мин, 10мин), су- пернатант (фракция еКох) подвергали ионообменной хроматографии на сефадексе ДЕАЕ А-50 из которой еКох элюировали 0,04М КФБ. Далее, после разбавления элюата водой (в 40 раз), его подвергали ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой ДЕ-52, из которой фракцию еКох элюировали 0,04М КФБ. Подвергнутая гель-фильтрации на колонке с сефедексом 0100 еКох (центральная фракция) имела электрофоретически гомогенное состояние [5]. Уровень Nox определяли путем измерения характерной для нее оптической плотности при 530нм (в полоса поглощения). Удельное содержание Nox из МКС, МККМ, ЯКС, ЭМ и еNOX определяли из расчета на 1мл раствора Nox, полученной из 1г селезенки, 1г костного мозга, 1мл сыворотки и 1мл эритроцитов.

Определение NADРН зависимой О₂^-продуцирующей активности изоформ Nox. NАДРН зависимую О2-продуцирующую активность Nox в гомогенной и гетерогенной фазах (непосредство в мембранах) определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента образующегося формазана при 560 нм в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу NАДРН зависимой О2-продуцирующей активности Nox принимали количество белка (плотность оптического поглощения β-полосы при 530нм), которое стимулирует образование формазана на 50%. Удельная NADPH зависимая О2-продуцирующая активность Nox была определена в расчете на 1мл эри-троцитов, 1мл сыворотки, 1г селезенки и 1г костного мозга [4].

Определение ферригемоглобин-восстанавливающей активности Nox. Ферригемоглобин (ферри- НЬ)-восстанавливающую активность изоформ Nox [11] в гомогенной и гетерогенной фазах (непосредственно в мембранах) определяли, используя свеже- полученный ферриНЬ цитозоли эритроцитов крыс с величиной плотности оптического поглощения (а-полоса поглощения) при А₅₆₅=0,8. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра, к 3мл раствора ферриНb добавляли 0,2мл Nox с А₅₃₀=0,3. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16ч при 3⁰о. Далее, после повторного перемешивания реак-ционной смеси определяли кинетику восстановления ферриНb до ферроНb путем измерения снижения плотности а-полосы поглощения ферриНЬ при 565нм (это снижение прямо-пропорционально количеству образующегося ферроНb при А₅₅₅). За единицу ферриНЬ-восстанавливающей активности Nox принимали количество белка, вызывающего снижение плотности максимального оптического поглощения а-полосы ферриНЬ величиной до 0,05 оптической единицы в течение часа при 20о. Удельная ферриНb-восстанавливающая активность изоформы Nox была определена в расчете на 1мл эритроцотов, 1 мл сыворотки, 1 г селезенки и 1 г костного мозга.

Условия воздействия преднизолона на изоформы Nox в гомогенной фазе (в растворв). В опытных пробах ПН (фирмы «Sigma», США) в количестве 10мг был растворен в этаноле (по 1мл) и добавлен к растворам (по 5 мл) приведенных электрофоретически гомогенных изоформ Nox (последние были растворены в 0,2М КФБ) in vitro (гомогенная фаза). K контрольным пробам были добавлены по 1 мл этанола в приведенном режиме. Контрольные (К) и опытные (Оп) пробы Nox из МККМ, МКС, ЯКС, ЭМ и из сыворотки крови (еКох) инкубировали при 36^о в течение 60мин. После центрифугирования проб при 12000об/мин в течение 10мин были определены оптические спектральные показатели, NADPH зависимая О₂^-продуцирующая и ферриИb-востанавливающая активности этих Nох.

Условия воздействия ПН на изоформ Nох в гетерогенной фазе. В опытных пробах ПН в количестве до 10мг были растворены в этаноле (по 1мл) и добавлены к смесям МККМ, МКС, ЯКС и ЭМ (по 5мл). К контрольным пробам были добавлены по 1мл этанола в приведенном режиме. Контрольные и опытные пробы МККМ, МКС, ЯКС, ЭМ инкубировали при 36^о в течение 60мин. Вначале были определены NADPH зависимая О₂^-продуцирующая и ферриИb-восстанавливающая активности этих ферментов в гетерогенной фазе (непостредственно в МККМ, МКС, ЯКС, ЭМ). Далее из них было осуществлено выделение фракций изоформ Кох по вышеприведенными способами, с определением их оптических спектральных характеристик и активностей. Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре “Specord UV/VIS” (Германия), с длиной оптического пути 1см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности «р».

Результаты и обсуждение

В гомогенной фазе, в результате инкубирования ПН (по 10мг) с растворами электрофоретически гомогенных изоформ Кох из ЭМ, МККМ, МКС, ЯКС и сыворотки крови в приведенных условиях происходит существенное снижение плотности характерного максимального оптического поглощения (при 530нм) этих Кох. При этом ПН не изменяет этот показатель у еКох (рис.1). С другой стороны, ПН не вызывает изменение формы оптических спектров поглощения приведенных Кох. Больше всего снижается плотность оптического поглощения Nох из ЭМ, далее из МККМ, МКС и, наконец, из ЯКС (рис.2). С увеличением доз ПН наблюдается повышение скорости tg наклона угла кинетических кривых) снижения плотности оптического поглощения Nох (при 530нм), которая выше у Nох из ЭМ, далее из МККМ, МКС и, наконец, из ЯКС (рис.3). Под влиянием ПН в указанном режиме также наблюдается снижение NADPH зависимой О₂^-продуцирующей и ферриИЬ- восстанавливающей активностей приведенных Nох из ЭМ. МККМ. МКС и ЯКС. В этих условиях активности у еКох практически не изменяются (таблица).

Под влиянием ПН также наблюдается снижение уровня и активностей Кох в гетерогенной фазе (непосредственно в ЭМ, МККМ, МКС и ЯКС), как это показано на рис.4. ПН вызывает необратимую агрегацию (потерия растворимости) изоформ Кох из клеточных компонентов органов иммунной системы (костный мозг, селезенка), а также из ЭМ в гомогенной и гетерогенной фазах. Об этом свидетельствует необратимое снижение  уровня

Таблица. NADPH зависимая О₂^- - продуцирующая и ферриHb-восстанавливающая активности Nox из контрольных (К) и опытных (ОП) проб, после воздействия 10 мг ПН. p‹ 0,03, П =6)

и активностей Кох, выделенных из приведенных объектов. Фактически в клеточных форморованиях ПН вызывает необратимую агрегацию Nох. Механизм необратимой агрегации Nох в гомогенной и гетерогенной фазах с соответснвенной потерей уровней, NADPH зависимой О₂^--продуцирующей и ферриИb-восстанавливающей активностей Кох под влиянием ультразвука, гамма-излучения [1], а также двуокиси углерода (предварительные результаты) связывается с необратимым изменениен изоэлектрической точки Кох. Этот механизм видимо действует и при инактивации этих ферментов преднизолоном. Таблетки ПН (по 5мг) применяют в клинике как противовоспалительный препарат. Мы использовали ПН ниже и выше этой дозы, для выявления дозозависимого воздействия ПН. Фактически ПН оказывает антивоспалительный эффект, подавляя О₂^--продуцирующую активность приведенных Nох, которые являются ключевыми ферментами продуцирования О₂^- клетками органов иммунной системы [12]. В данном исследовании используемые дозы ПН могут подавлять не только активность иммунной системы, но и осляблять кислородный гомеодтаз, путем снижения ферриИb- восстанавливающей активности Nох. При этом толерантность Nох против ПН несравнвнно выше у еNох, далее у Nох из ЯКС, МКС и, в последнюю очередь, из МККМ и ЭМ. Механизм повышенной толерантности еКох из сыворотки крови, скорее всего, связан с высокой стабильностью этого фермента в отношении внешних факторов.

   Рис.1. Оптические спектры поглошения электрофоретически гомогенных изоформ Nox без инкубирования (а -1) и после инкубирования Nox с 10 мг ПН) из: ЯКС (а -2), МКС (а-3), ЭМ (а-4). То же самое у Nox из МККМ без инкубирования (б-1) и после инкубирования с 10 мг ПН (б-2). Оптические спектры поглощения eNox без инкубирования (----) и после инкубирования с 10 мг ПН (в-1) в течение часа, при 36^о

Рис. 2. Относительное изменение (%) уровня (плотность оптического поглощения при 530 нм) изоформ Nox в гомогенной фазе по сравнению с 100% -ными контрольными показателями до (1) и после инкубации с ПН (10 мг, в течение часа при 36^о) с Nox из: сыворотки крови (2)., ЯКС (3)., МКС (4)., МККМ (5) и ЭМ (6)

Рис. 3. Скорость tg угла наклона кинетических кривых) снижения плотности оптического поглощения изоформ Nox (при 530 нм) после их инкубации в течение часа при 36^o с ПН. Показатели Nox из: ЭМ (1), МККМ (2), МКС (3) и ЯКС (4)

Рис. 4. Относительное изменение NADPH зависимой О ₂^--продуцирующей и ферриHb-восстанавливающей активностей Nox в гетерогенной фазе, непосредственно в ЭМ, МККМ, МКС, ЯКС (эти активности изменяются аналогичным образом) после их инкубирования с 10 мг ПН в течение часа при 36о по сравнению с 100%-ными контрольными показателями (1): для ЯКС (2), МКС (3), МККМ (4) и ЭМ (5) . Аналогичным образом изменяются и уровни (плотность оптического поглощения при 530 нм) Nox после их выделения из этих мембран

Таким образом, во избежание необратимого подавления иммунной активности и кислородного гомеостаза, необходим более осторожный подбор эффективных доз применяемого ПН.

Список литературы

1. Мелконян Л.Г., Симонян Р.М., Секоян Э.С., Симонян Г.М., Симонян М.А. ДНАН РА, 2009, 109(3): 225-235. 7.
2. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Лицензия изобрет.Армпатента, К 2233 А. Ереван, 2008.8.
3. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Лицензия изобрет.Армпатента, К 908. Ереван, 2001.9.
4. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Симонян М.А., Галоян А.А. Мед. наука. Армении, 2003, 10. ХЬШ(1): 30-34.
5. Симонян М. А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Лицензия 11. изобрет.Армпатента, К 341. Ереван, 1997.
6. Marumo T., Schini-Kerth V.B., Brandes R.P., Busse R. Hypertension, 1998, 32(6): 1083-1088.
7. Miesel R., Hartung R., Kroeger H. Infl ammation, 1996, 20(4): 427-438.
8. Muzaffar S., Shukla N., Angelini G.D., Jeremi J.Y. Br.J.Pharmacol., 2005, 145(5): 688-697.
9. Roshol H., Strede K.K., Aero C.E., Wiik P. Eur.J.Pharmacol., 1995,286(1): 9-17.
10. Sanner B.M., Meder U., Zidek W., Tepel M. Steroids, 2002, 67(8):715-719.
11. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. Electronic J. Natural Sci. NAS RA, 2006, 2(7): 3-6.
12. Vignais P.V. Cell Mol. Life Sci., 2002, 59(9): 1428-1459.

Вопросы, ответы, комментарии