Повышение уровня изоформ NADPH оксидазы из плацентарной крови женщин по сравнению с показателями венозной крови

Активные формы кислорода (АФК) играют ключевую роль в функционировании клеток плаценты. При увеличении содержания АФК (О₂^-, НО^., пероксинитрит) при патологических состояниях наблюдается оксидативное повреждение клетокн плаценты [1]. При этом в эндотелиальных клетках сосудов плаценты наблюдается экспрессия NADPH оксидазы (р22, р47, р67 фагоцит оксидазы и Rac1) in vivo и in vitro. Под влиянием фактора роста эндотелиальных клеток (ФРЭК) одновременно наблюдается увеличение уровня Rac1 и ассоциация последнего с NADPH оксидазой (р67). В этих условиях продуцирование внутриклеточных супероксидных радикалов увиливается in vitro через 25-30 мин после подачи ФРЭК [2]. Плацента рагулирует развитие плода путем синтеза и секресии стероидных и пептидных гормонов, а эндотелиальные клетки плаценты продуцируют О₂^-, которые присоединяясь с N0 образуют пероксини- трит, как более токсичного вещества для биосистем [3]. При патологических состояниях, в ходе которых образуются серповидные эритрициты, наблюдается усиление воспалительных процессов с стимулированием экспрессии 5-липоксигеназы, которая совместно с фактором развития плаценты вызывают активацию фосфоинозитид киназы и NADPH оксидазы [4]. При беременности происходит повышение активности митохондрий плаценты с усилением продуцирования О₂^- и N0. и пероксинитрита, которые вызывают пролиферацию трофобластов и изменение функционирования сосудов. При этом стимулируется липидная пероксидация и снижение экспрессии и активности антиоксидантов, вызывающих оксидативное повреждение клеток плаценты [5].

К настоящему времени практически не определены уровень и активность изоформ NADPH оксидазы из эритрицитарных мембран (ЭМ) и сыворотки плацентарной крови женщин (ПКЖ). Целью работы являлось определение этих показателей и сравнение их с показателями венозной крови женщин (ВКЖ).

Материал и методы

ПКЖ (по 20мл) и ВКЖ (по 10мл) стабилизировали 0,2% раствором лимонокислого натрия. Для получения экстрацеллюлярной NADPH оксидазы из сыворотки крови, кровь инкубировали в аэробных условиях при 4о в течение трех суток и далее осуществляли процедуру выделения из проб крови фракций изоформ NADPH оксидазы.

Выделение и очистка изоформы NADPH оксидазы из ЭМ ПКЖ и ВКЖ. Фракцию NADPH оксидазы выделяли путем их солюбилизации из ЭМ, диализа против воды, центрифугирования и ионообменной хроматографии супернатанта на колонке с целлюлозой KM-52 и DE-52 [6].

Выделение и очистка изоформы экстрацеллюлярный NADPH оксидазы из сыворотки ПКЖ и ВКЖ. После инкубирования ПКЖ и ВКЖ течение 3 суток при 4^оС и центрифугирования при 6000об/ мим в течение 8мин, сыворотку крови отделяли и дополнительно центрифугировали при 12000об/мин, 15мин (для полного удаления плазменных элементов и следов эритроцитов) и подвергали диализу против воды. После центрифугирования диализата (6000об/ мин, 10мин) фракцию экстрацеллюлярной NAD PH оксидазы из надосадочного раствора выделяли ионообменной хроматографией на сефадексе ДЕАЕ А-50. и элюировали 0,04М калий фосфатным буфером (КФБ). Далее, после разбавления элюата водой (в 20 раз) осуществляли ионообменное хроматографирование на колонке с целлюлозой ДЕ-52. Фракцию экстрацеллюлярноой NADPH оксидазы вделяли элюированием 0,04М КФБ [7]. Уровень NADPH оксидазы (цитохрома b₅₅₈) определяли путем измерения характерной для цит b₅₅₈ оптической плотности при 530нм (β полоса поглощения). Удельное содержание NADPH оксидазы из ЭМ и сыворотки ПКЖ и ВКЖ определяли из расчета на 1мл раствора NADPH оксидазы полученного из 1мл эритроцитов и 1мл сыворотки.

Определение NАDРН зависимой О₂^- - продуцирующей активности изоформ NADPH оксидаз из ЭМ и сыворотки ПКЖ и ВКЖ. NАДРН зависимую О₂^-- продуцирующую активность изоформ NADPH окси- дазы определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента образующегося формазана (при 560нм) в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу NАДРН зависимой О₂^-- продуцирующей активности NADPH оксидазы принимали количество белка (плотность оптического поглощения в-полосы при 530нм), которое стимулирует 50%-ое образование формазана. Удельная NADPH зависимая О₂^- -продуцирующая активность NADPH оксидазы была определена в расчете на 1мл эритроцотов, 1мл сыворотки [8].

Определение ферриНb-восстанавливающей активности NADPH оксидаз из ЭМ и сыворотки ПКЖ и ВКЖ. ФерриНb-восстанавливающую активность изоформы NADPH оксидазы [9] определяли, используя свежеполученный ферриНb из цитоплазмы эритроцитов человека с величиной плотности оптического поглощения (a-полоса поглощения) при А₅₆₅ = 0,8 оптической единицы. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра, к 3мл раствора ферриНb добавляли 0,2мл NADPH оксидазы (цит b₅₅₈) с А₅₃₀ = 0,3. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях

Рис.1 Оптические спектры поглощения изоформ NADPH оксидазы из сыворотки и ЭМ ПКЖ и ВКЖ. а - спектры NADPH оксидаз из сыворотки ПКЖ (1), из сыворотки ВКЖ (2) и (3) после разбавлвния 1-ого или 2-ого и восстановления дитионитом натрия (- - -). б - спектры NADPH оксидаз из сыворотки ВКЖ (1), из сыворотки ВКЖ (2) и (3) после разбавлвния 1-ого или 2-ого и восстановления дитионитом натрия (- - -). Перед регистрацией оптических спектров поглощения растворы NADPH оксидаз из ЭМ ПКЖ и ВКЖ были разбавлвны 0,2 м калий фосфатным буфером (рН 7,4) в 3 раза.

в течение 15-16 ч при 30о. Далее после повторного перемешивания реакционной смеси кинетику вос-становления ферриЫЬ до ферроНЬ определяли путем измерения снижения плотности a-полосы поглощения ферри НЬ при 565нм, которое прямо пропорционально количеству образующегося ферроНb при А₅₅₅. За единицу ферриНЬ-восстанавливающей активности NADPH оксидазы принимали количество белка, вызывающего снижение плотности максимального оптического поглощения a-полосы ферриЫЬ величиной на 0,05 оптическую единицу в течение часа при 20^оС. Удельная ферриНb-восстанавливающая активность изоформы NADPH оксидазы была определена в расчете на 1мл эритроцотов и 1мл сыворотки [9]. Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре “Specord UV/VIS” (Германия) с длиной оптического пути 1см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности «р».

Результаты и обсуждение

Впервые из ЭМ и сыворотки ПКЖ выделены фракции изоформ NADPH оксидазы кислой натуры с использованием методов [6,7] с характерными оптико-спектральными свойствами и активностями. Из 10мл ЭМ ПКЖ получается 10мл фракции NADPH оксидазы с плотностью поглощения (при 530нм) 0,64 оптической единицы. Из 10мл сыворотки ПКЖ получали 10мл экстрацеллюлярной КЛБРН оксидазы с плотностью оптического поглощения 0,16 оптической единицы. Эти показатели сравнивались с показателями КЛБРН оксидаз из сыворотки и ЭМ ВКЖ. Оптические спектры поглощения изоформ NADPH оксидазы кислой пророды из сыворротки ПКЖ и ВКЖ по форме и максимумам оптического поглощения практически не отличаются. У NADPH оксидазы из ЭМ ПКЖ и ВКЖ имеются характерные максимумы оптического поглощения в окисленном состоянии (412, 530 и 560нм) и в восстановленном дитионитом состоянии (418, 525 и 558нм). У экстрацеллюлярной NADPH оксидазы из сыворотки ПКЖ и ВКЖ также имеются указанные максимумы оптического поглощения, а также поглощение при 485нм, которое имеется только у экстрацеллюлярной КЛБРН оксидазы (рис. 1). С другой стороны удельное содержание (плотность характерного максимального опти-ческого поглощения при 530нм, бета-полоса поглощения) у изоформ NADPH оксидазы из сыворотки и ЭМ ПКЖ выше на 21,8 ± 3,2 % (р‹0,05) и 34,3 ± 5,1 % (р‹0,03) соответственно, как это показано в таблице. С другой стороны NADPH-зависимая О₂^- -продуцирующая и ферриНb-восстанавливающая активности изоферм NADPH оксидазы из ЭМ и сыворотки ПКЖ практически не отличаются от этих показателей у NADPH  оксидазы из ЭМ и сыворотки ВКЖ.

Таблица. Изменение уровня (плотность максимального оптического поглощения при 530 нм),NADPH — зависимой О₂^- - продуцирующей и ферриИb-восстанавливающей активностей изоформ NADPH оксидазы из ЭМ и сыворотки ПКЖ и ВКЖ

Таким образом, за счет увеличения уровня изоферм КЛБРН оксидазы в ЭМ и сыворотке крови беременных женщин, обеспечивается достаточный уровень О₂^- для физиологически необходимых промежуточных процессов с участием О₂^-, а также для регуляции кислородного гомеостаза и иммунной активности плода.

Список литературы

1. Parrish M.R., Walace K., Tam Tam KB., Herse F.Am.J.Hypertens., 2011, 24(7): 835-840.
2. Li S.M., Zeng L.W., Feng L., Chen D.B. Ednocrinology,2010, 151(11): 5313-5325.
3. Myatt L. Placenta, 2010, Suppl:S66-S69.
4. Patel N., Gonsales C.S., Yang M., Malik P., Kalra V.K.Blood, 2009, 113(5): 1129-1138..
5. Myatt L., Cui X. Histochem.cell Biol., 2004, 122(4): 369382.
6. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Способ получения цитохрома b₅₅₈ из эритроцитарных мембран. Лицензия изобрет. Армпатента, N 908. Ереван, 2001.
7. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян РМ. Способ получениия металлопротеинов крови. Лицензия изобрет.Армпатента, N 341. Ереван, 1997.
8. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Симонян М. А., Галоян А. А. Мед. наука. Армении, 2003,XLIII(1), 30-34.
9. Simonyan G.M., Simonyan R.M., Simonyan M.A. Elec-tronic J. Natural Sci. NAS RA, 2006, 2(7): 3- 6.

Вопросы, ответы, комментарии