Влияние литиевой соли гамк на субклеточный метаболический профиль ь-аргинина в гиппокампе и гипоталамусе крыс при хроническом стрессе

Введение

Хронический стресс (ХС), в отличие от острого, сопровождается значительными нейрохимическими изменениями в головном мозге и является фактором риска развития большой депрессии (БД) и тревожных расстройств [21]. Клинические и экспериментальные наблюдения свидетельствуют в пользу того, что депрессивное состояние может возникать в результате нарушения функций целого ряда систем, включая моноаминергическую, гипоталамо-гипофизарно- адренокортикальную, интерлейкинов и прочих, которые взаимосвязны, но в каждом конкретном случае вклад одной из них может оказаться преобладающим, и терапия, нацеленная на ее коррекцию, будет эффективной [6]. В этой связи особый интерес представляет универсальный мессенджер оксид азота (К0), который участвует в процессах нейротрансмиссии, влияя на механизмы обучения и памяти, психический статус, эмоции и поведение [4,5]. На сегодняшний день накоплено множество данных о вовлечении L-аргининзависимого синтеза КО в патогенетические механизмы стрессиндуцированных болезней, включая психические расстройства и развитие депрессивных состояний [17].

В головном мозге функционируют основные изоформы NО синтазы (NOS), кальцийзависимые “конститутивные” NOS (сNOS), нейрональная, которая участвует в механизмах нейротрансмиссии, эндотелиальная, регулирующая мозговой кровоток и кальцийнезависимая “индуцибельная” (iNOS), функционирующая в рамках врожденного иммунного ответа Аlderton [8]. Недавно открыта конститутивная форма К08, локализованная во внутренней мембране митохондрий тканей головного мозга [19]. Мито-хондриальная NOS участвует в обратимом ингибировании цитохром оксидазы, функционально связана с комплексом I митохондриальной дыхательной цепи, при инактивировании которого оказывает прооксидантное действие [28]. Известно, что К0 ингибирует цитохром оксидазу, подавляя клеточное дыхание, и вызывает деполяризацию мембран и дисфункцию митохондрий [10], сопровождающуюся нарушениями клеточного энергообмена и нейропластических процессов, которые участвуют в патогенезе психических расстройств [29].NO опосредует глутаматергическую нейротрансмиссию - связь между глутаматом, ГАМК и L-аргинином и его метаболитами прослеживается во многих отделах мозга [23]. Глутамат- ГАМКергическая “цепочка” контролируется нейро- модуляторными системами, включая нитрергическую, которая относится к факторам, вовлеченным в патофизиологию депрессии и действие антидепрессантов [9]. Ранее, в разработанной нами модели ХС- индуцированного депрессивноподобного поведения крыс, впервые были продемонстрированы реги- онспецифические сдвиги продукции NO, связанные с разнонаправленной регуляцией разных изоформ NOS в митохондриальном и цитозольном компартментах структур лимбической системы мозга [1]. В настоящей работе исследовалось влияние литиевой соли ГАМК на субклеточный метаболический профиль L-аргинина в гиппокампе и гипоталамусе крыс на собственной модели ХС-индуцированного депрессивноподобного состояния крыс.

Материал и методы исследования

Эксперименты проводили на половозрелых белых крысах-самцах линии Вистар массой 100-140г, которые содержались в виварии, в условиях естественного освещения и свободного доступа воды и пищи. Животные были разделены на четыре группы (n= 18/группу): контрольная - здоровые крысы; три опытные группы - крысы, подвергнутые воздействию стрессирующих факторов и декапитированные сразу после 14-дневного ХС, 4 дня спустя и через 2 дня после одноразовой обработки литиевой солью ГАМК в дозе 0,9 мг/кг массы животного (0,3 мл препарата вводили внутрибрюшинно спустя 2 дня после ХС). ХС осуществляли по описанной ранее собственной методике: крыс в течение 14 дней подвергали воздействию одного или двух стрессирую- щих факторов из шести (принудительное плавание, вдыхание паров эфира, лишение пищи, иммобилиза- ционный, холодовой и ортостатический стресс), которые для предотвращения предсказуемости повторялись через каждые два дня с разной длительностью воздействия и в определенные часы, с учетом циркадианных ритмов, в результате чего у крыс раз-вивалось депрессивноподобное поведение [2].

Выделение митохондриальной и цитозольной фракций тканей отделов мозга. Животных декапитировали, на льду из головного мозга извлекали ПФК и стриатум, гомогенизировали в 10 объемах 20мМ HEPES буфера, рН-7,4, содержащем 0,25М сахарозу и выделяли цитозольную и несинаптическую обогащенную нейронами и глией митохондриальную фракции [12].

Активность NOS определяли по аккумуляции NO и его стабильных метаболитов (окислы азота (NO₂^-, NO₃^-, N₂O₄, N₂O₃), нитрозотиолы и т.д.) после долговременной инкубации проб (24ч, 37^оС) в 20мМ HEPES буфере pH-7,4, содержащем 2мМ дитиотреитол, 3мМ MgCl₂.6H₂O в присутствии 5,3 мМ L-аргинина, 0,2мМ NADPH, 20 мкМ (6R)-5,6,7,8- тетрагидробиоптерина, 6мкМ FAD и 5,5мкМ FMN. Общая активность NOS определялась при инкубации проб в присутствии 1,7мМ CaCl₂, активность iNOS - в присутствии 5мМ ЭДТА (без CaCl₂ в инкубационной среде); активность сNOS вычислялась по разности между общей активностью NOS и активностью iNOS. В параллельных контрольных экспериментах пробы инкубировали в присутствие 5мМ N(омега)- монометил L-аргинина, конкурентного неселективного природного ингибитора NOS. Активность NOS выражали в нмоль (NO₂^- ) • мг^-1 белка • 24 ч^-1.

Содержание NO и его стабильных метаболитов в супернатантах депротеинизированных проб определяли с использованием реактива Грисса- Илосвая спектрофотометрически при длине волны 546м [30].

Определение содержания L-аргинина осуществляли модифицированным методом Akamatsy и Watanabe [7]. Супернатанты депротеинизированных проб смешивали с рабочим раствором (смесь растворов: 0,02% 8-оксихинолина в 96%-ном этиловом спирте с 2,5% сульфосалицилата натрия в 0,01М растворе глицина и 2,5% NaOH, 1:1:1 по объему) и 1% гипобромитом натрия в соотношении 3:1:0.2 по объему и оценивали содержание L-аргинина спектрофо-тометрически при длине волны 525нм.

Содержание белка определяли методом Лоури [25].Статистика. Достоверность различий при множественных сравнениях оценивали с использо-ванием параметрического однофакторного дисперсионного анализа (one-way Anova) с последующим постдисперсионным анализом Холм-Сидака с помощью пакета программ SigmaStat 3.5 for Windows. Анализ корреляций проводили на основе расчета ко-эффициента линейной корреляции Пирсота (r). В ка-честве критерия достоверности принимали р‹ 0.05.

Результаты и обсуждение

На рис. 1 представлены результаты анализа in vivo субклеточного содержания субстрата NOS L-аргинина и продуктов NOS реакции NO и его стабильных метаболитов (активных форм азота, АФА) в гиппокампе крыс. Сразу после стресса (группа 1) и спустя 4 дня после прекращения воздействия стрессирующих факторов (группа 2) в цитозоле тканей гиппокампа повышается содержание L-аргинина в 2.9- и 9.3 раза и АФА в 5.5- и 9.3 раза соответственно. В митохондриях гиппокампа в группе 1 концентрации L-аргинина и АФА также резко возрастают в 15- и 8 раз, а в группе 2 их уровень снижается, однако превышает контрольные значения в 5- и 2.5 раза соответственно. Через два дня после ХС крысам одноразово внутрибрюшинно вводили литиевую соль ГАМК в дозе 0.9мг/кг, которая соответствовала су- бэффективным дозам лития (1мг/кг), влияющим на поведенческие реакции грызунов Kiyani А. [22] и втрое ниже дозы ГАМК (2.6мг/кг), оказывающей антидепрессантное воздействие на стрессированных крыс в тесте принудительного плавания Cuang С.Y. [13]. Препарат снижает до нормы содержание аргинина и АФА в цитозоле, и аргинина в митохондриях, тогда как на содержание АФА в последних статистически достоверного воздействия не оказывал. При этом в гиппокампе наблюдается положительная корреляция между уровнями аргинина и АФА в цитозоле (г=0.96) и митохондриях (г=0.99).

Рис. 1. Влияние литиевой соли ГАМК на субклеточное содержание L-аргинина и NO и его стабильных метаболитов в гиппокампе крыс при ХС. Результаты представлены в виде М ± SЕМ, n=18, достоверность различий при сравнении всех групп: F=89.93, р ‹0.001; F=48.62, р ‹0.001 (относительно L-аргинина) и F=26.9, р‹ 0.001; F=10.98, р‹0.001 (относительно NO и его стабильных метаболитов) в цитозоле и митохондриях соответственно

Как видно из рис. 2, ХС вызывает более выра-женные изменения в интрацеллюлярном уровне ар-гинина и АФА в гипоталамусе. В группе 1 содержание аргинина возрастает в цитозоле и митохондриях в 9.9- и 11.7 раза, а в группе 2- в 9.9- и 11.1 раза соответственно, по сравнению с контрольной группой. Одновременно в группе 1 содержание АФА повышается в цитозоле и митохондриях гипоталамуса в 3.3- и 8.7 раза, а в группе 2- в 11.2- и 9.85 раза соответственно, по сравнению с контролем. Одноразовая обработка литиевой солью ГАМК снижает в клеточных компартментах гипоталамуса уровень аргинина и АФА даже несколько ниже нормы, и они достоверно позитивно коррелируют между собой в цитозоле и митохондриях (г=0.76 и г=0.97 соответственно).

Рис. 2. Влияние литиевой соли ГАМК на субклеточное содержание L-аргинина и NO и его стабильных метаболитов в гипоталамусе крыс при ХС. Результаты представлены в виде M ± SEM, n=18, достоверность различий при сравнении всех групп: F=99.37, p ‹0.001; F= 78.53, p ‹0.001 (относительно L-аргинина) и F=55.37, p‹0.001; F=16.49, p‹0.001 (относительно NO и его стабильных метаболитов) в цитозоле и митохондриях соответственно

Следует отметить, что мембранный потенциал митохондрий экспоненциально модулирует высво-бождение NO в цитозоль: в сердце доля цитозольного NO, диффундирующего из митохондрий, составляет 90%) Valdez L.B. [32]. Дофамин, концентрация которого изменяется при стрессе и влияет на поведенческие характеристики, может оказывать воздействие на поглощение митохондриями кислорода и их мембранный потенциал [14]. Причем аргинин способен влиять на эти процессы - введение аргинина снижает базальный уровень дофамина в пре- фронтальном кортексе крыс через 48ч после инъекции основного компонента сенильных бляшек мозга бета-амилоида (Abetal-42) Trabace L. [30]. Таким образом, взаимосвязь между аргинином и АФА носит как прямой, так и опосредованный характер.

Повышение концентрации цитозольного аргинина в исследуемых отделах головного мозга может оказывать ингибирующее воздействие на механизмы активного поглощения креатина митохондриями, влияя на их энергетическое состояние [16]. К тому же увеличение содержания NO может способствовать процессам нитрозилирования сульфгидрильных групп креатинкиназы с подавлением ее активности [27]. Устойчивое повышение содержания аргинина в гиппокампе и гипоталамусе может быть связано как с активированием его синтеза, так и с подавлением утилизации аргинина aргининметаболизирующими ферментами. К ним относится аргиназа, которая лимитирует содержание аргинина в тканях, и в головном мозге грызунов представлена цитозольной и митохондриальной изоформами [36]. По-видимому, при ХС пути превращения аргинин→орнитин→тлутамат→ГАМК ингибируются внутри клетки в важнейших клеточных компартментах, а введение препарата ГАМК будет препятствовать торможению этих реакций. В пользу наших предположений свидетельствуют данные о том, что у пациентов с биполярными аффективными расстройствами происходит падение аргиназной актив-ности, которое сопровождается возрастанием концентрации аргинина и значительным повышением уровня нитритов в плазме [35].

При ХС возможно ингибирование и аргининдекарбоксилазы, которая, наряду с аргиназой, не только конкурирует с NOS за общий субстрат, но и синтезирует агматин, подавляющий активность NOS [20], в то время как аргиназа продуцирует мочевину, инги-бирующую самосборку активных димеров NOS [26]. Эти ферменты вовлечены в синтез ряда аминов (путресцин, агматин) и полиаминов (спермин, спермидин), которые участвуют в механизмах иммунного и стрессового ответов организма, проявляют антидепрессантное и анксиолитическое действие и могут оказывать влияние на патофизиологические механизмы психических расстройств [18]. Наши предположения подтверждаются данными о том, что в гиппокампе крыс, подвергнутых повторяющемуся иммобилизационному стрессу, происходит 75%-ное, а в гипоталамусе-51%-ное падение содержания агматина, введение последнего предотвращало стресс- индуцированные структурные повреждения мозга в этих регионах [37].

Долговременная инкубация субклеточных фракций гиппокампа и гипоталамуса показала, что L-аргининзависимый синтеза NO in vitro подавляется при введении в состав реакционной среды 5мМ N(омега)-монометил L-аргинина (L-NMMA), природного конкурентного неселективного ингибитора всех исследуемых изоформ NOS, что подтерждает их вклад в генерирование АФА. Как видно из рис.3,в гиппокампе активность cNOS падает в цитозоле в 3.7- и 2.6 раза в группах 1 и 2 соответственно, тогда как в митохондриях ее колебания недостоверны.

В то же время активность 1К08 резко возрастает цитозоле в 32.5 раза (группа 1) и также резко падает на 4-й день после стресса (группа 2), но и в этом случае в 4.6 раза превышает норму; в митохондриях обнаружена слабая тенденция к повышению iNOS (1.4- и 1.9 раза в группах 1 и 2 соответственно). Одноразовая субэффективная доза литиевой соли ГАМК нормализует в гиппокампе активность iNOS в цитозоле и подавляет ее в митохондриях, вызывая ее падение ниже нормы, но не оказывает воздействия на с NOS.

Рис. 3. Влияние литиевой соли ГАМК на субклеточную активность конститутивной и индуцибельной изоформ NOS (cNOS и iNOS, соответственно) в гиппокампе крыс при ХС. Результаты представлены в виде M ± SEM, n=18, достоверность различий при сравнении всех групп: F=14.21, р ‹0.001; F=0.88, р=0.454 (относительно cNOS) и F=49.33, р ‹0.001; F=12.09, р ‹0.001 (относительно iNOS) в цитозоле и митохондриях соответственно

В тканях гипоталамуса ХС также сопровождается подавлением cNOS в цитозоле и митохондриях в 4.7- и 2.9 раза (группа 1) и 1.8- и 2 раза (группа 2) соответственно, и одновременно стимулированием iNOS с повышением ее активности в цитозоле и ми-тохондриях примерно в 12- и 8 раз (группа 1), и 7- и 52.6 раза (группа 2) соответственно, по сравнению с контролем (рис. 4). Любопытно, что в гипоталамусе литиевая соль ГАМК не изменяет паттерн активности iNOS в клеточных компартментах и таковой ми-тохондриальной cNOS, но стимулирует тенденцию восстановления активности cNOS в цитозоле в пост- стрессорный период.

Рис. 4. Влияние литиевой соли ГАМК на субклеточную активность конститутивной и индуцибельной изоформ NOS (cNOS и iNOS, соответственно) в гипоталамусе крыс при ХС. Результаты представлены в виде M ± SEM, n=18, достоверность различий при сравнении всех групп: F= 14.48, р ‹0.001; F= 12.75, р ‹0.001 (относительно cNOS) и F=6.49, р

ХС-индуцированное снижение активности cNOS в гиппокампе и гипоталамусе будет отражаться на процессах нейротрансмиссии. Фармакологические исследования показывают, что введение ингибиторов нейрональной NOS снижают локомоторную активность у грызунов [15] и уровень дофамина [31], что ассоциируется с развитием у них депрессивноподобного поведения. Снижение общей актив-ности сNOS, наблюдаемое в гиппокампе и гипоталамусе при ХС, по всей видимости, отражает снижение активности дофаминергической системы, которая, согласно последним данным, стимулирует сNOS в стриатуме [3]. Сдвиги в активности изоформ NOS свидетельствуют о том, что именно iNOS вызывает гиперпродукцию АФА в исследуемых клеточных компартментах гиппокампа и гипоталамуса. Следует отметить, что в отличие от конститутивных изоформ, iNOS способна продуцировать NO в течение нескольких дней и стойко повышать его уровень [24]. Будучи высокопроизводительной формой она больше, чем cNOS зависит от концентрации аргинина в среде и выявленное нами ХС-индуцированное повышение содержания этой аминокислоты, возможно, является одним из факторов стимулирующих iNOS в подобных условиях. Недавно было продемонстрировано, что подавление активности iNOS в гиппокампе оказывает антидепрессантное действие при ХС [34]. Примечательно, что экзогенный L-аргинин подавляет анксиолитическое действие диазепама сти-мулируя продукцию NO в гиппокампе и коре головного мозга крыс [33]. Активирование iNOS в свою очередь может способствовать повышению содержания интрацеллюлярного аргинина, поскольку первый интермедиат реакции NOS N^G-гидроксиаргинин является мощным ингибитором аргиназы, лимитирующей уровень аргинина в органах и тканях [11].

Различия в регуляции изоформ К08 проявляются и в различном влиянии на них литиевой соли ГАМК, одноразовая щадящая доза которой оказалась недостаточной для модулирования субклеточной активности сК08, однако препарат подавляет ХС-индуцированное устойчивое активирование 1К08 в митохондриях и цитозоле гиппокампа, препятствуя перепродукции К0 и развитию разрушительных биохимических процессов. Избыток К0 ингибирует ферменты, ответственные за репарацию ДНК, при стрессе он взаимодействует с активными формами кислорода с образованием его более агрессивной формы пероксинитрита (ПН), который ингибирует в митохондриях цикл трикарбоновых кислот, железосерные центры 1-111 комплексов дыхательной цепи, нитрозилирует мембранные тиолы и цитохрома С, нарушая перенос электронов в дыхательной цепи, одновременно происходит выход цитохрома С (в том числе и нитрованного) в цитоплазму, запуская процессы апоптоза с открытием гигантской митохон-дриальной поры Bolanos J.P., Heales S.J. R. [10].

Резюме

Таким образом, ХС-индуцированное депрес-сивноподобное состояние крыс сопровождается по-вышением содержания L-аргинина и сопряженным стимулированием iNOS и продукции NO и его ста-бильных метаболитов, а также и подавлением актив-ности cNOS в цитозоле и митохондриях гиппокампа и гипоталамуса. Одноразовая внутрибрюшинная инъекция в постстрессовый период субэффективной дозы литиевой соли ГАМК нормализует содержание L-аргинина в цитозоле и митохондриях вышеуказанных регионов мозга и предотвращает стимулирование системы iNOS/NO в цитозоле и митохондриях гиппокампа и связанное с ним устойчивое повышение содержания АФА, вызывающие нитрози- рующий стресс и дисфункцию митохондрий а также способствует восстановлению активности цитозольной cNOS в гипоталамусе. Различия во влиянии литиевой соли ГАМК на нитрергическую систему мозга могут быть обусловлены спецификой региона, дозировкой препарата и/или его разновременным влиянием, что еще предстоит выяснить. Дальнейшие исследования в этом направлении будут способствовать выяснению внутриклеточных механизмов депрессивных расстройств и разработке новых путей их профилактики и терапии.

Список литературы

1. Назарян Н. С. Мед. наука Армении НАН РА, 2011, т. LI (2), с. 21-33.
2. Назарян Н.С., Мовсесян Н.О., Алчуджян Н.Х., Мовсе- сян О. А., Геворкян А.Г., Айрапетян Р.Л., Геворкян Г. А. Мед. наука Армении НАН РА, 2011, т. LI (1), с. 62-74.
3. Савельев С.А. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова, 2005, т. 91, N 8, с. 942-948.
4. Серая И.П., Нарциссов Я.Р. Успехи Совр. Биол., 2002, Т. 122, N 3, c. 249-258.
5. Сосунов А.А. Сорос. Образ. Журн., 2000. N10, c. 105110.
6. Шишкина Г.Т., Дыгало Н.Н. Журн. высш. нерв. деят.,2010,т. 60, 2, с. 131-152.
7. Akamatsy S., Watanabe T.J. J. Biochem., 1961, v. 77 (3), p. 484.
8. Alderton W.K., Cooper C.E., Knowles R.G. Biochem. J.,2001,v. 357, p. 593-615.
9. Barbosa L., Resstel M., Guimaraes F.S. Cereb Cortex,2008,v. 18 (9), p. 2027-2035.
10. Bolanos J.P., Heales S.J.R. Front Neuroenergetics, 2010, v. 2, p. 1-9.
11. Buga GM, Singh R, Pervin S. et al. Am. J. Physiol., 1996, v. 271, H1988.
12. Bustamante J., Czerniczyniec A., Lores-Arnaiz S. Front. Biosci., 2007, v. 12, p. 1034-1040.
13. Cuang C.Y., Shi Y.C., You H.P., Pan T.M. Agric. Food Chem., 2011, v. 59 (7), p. 3027-3034.
14. Czerniczyniec A., Bustamante J., Lorez-Amaiz S. Mol. Cell Biochem., 2010, 341(1-2), p. 251-257.
15. Del Bel E.A., Guimaraes F.S. et al. Cell Mol. Neurobiol., 2005, v. 25, p. 371-392.
16. Dolder M., Walzel B., Speer O., Wallimann T. J. Biol. Chem., 2003, v. 278(20), p.17760-17766.
17. Esh T., Stefano G.B., Fricchione G.L., Benson H. Med. Sci. Monit., 2002, v. 8 (6), p. 103-118.
18. Fiori L.M., Turecki G. J. Psychiatry Neurosci., 2008, v. 33(2), p. 102-110.
19. Guilivi C. Novaris Found Symp., 2007, v. 287, p. 92-100.
20. Halaris A., Plietz J. CNS drugs, 2007, v. 21, 11, p. 885900.
21. Jankord R., Herman J.P. Ann. N Y Acad. Sci., 2008, v. 1148, p. 64-73.
22. Kiyani A., Javadi-Paydar M. et al. Behav. Brain. Res.,2011,v. 219 (2), p. 240-247.
23. Liu P., Jing Y., Zhang H. Neuroscience, 2009, v.164 (2), p. 611-628.
24. Lowenstein, C. J., Padalko, E. iNOS (NOS2) at a glance. J. Cell Sci., 2004, v. 117, p. 2865-2867.
25. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265-275.
26. Moeslinger T., Friedl R. et al. Kidney Int., 1999, V. 56, N 2,P. 581-588.
27. Murphy M.P. Nitric oxide and cell death. Biochem. Biophys. Acta. 1999, v. 1411, p. 401-414
28. Parihar M.S., Parihar A. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008, v. 367, 4, p. 761-767.
29. Rezin G.T., Amboni G. et al. Neurochem. Res., 2009, v.34,p. 1021-1029.
30. Schmidt H.H.H.W., Kelm M. Chichester; 1996, p. 491497.
31. Trabace L., Kendrick K.M. et al. Neuroscience. 2007, v. 147(3), p. 652-663.
32. Valdez L.B., Boveris A. Front. Biosci., 2007, v. 12, p. 1210-1219.
33. Volke V., Soosaar A., Koks S., Mannisto P.T. Eur. J. Pharmacol., 1998, v. 351 (3), p. 287-290.
34. Wang D., An S.-C., Zhang X. J. Neurosci. Lett., 2008, v. 433, p. 59-64.
35. Yanik M., Vural H., Tutkun H. et al. Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci., 2004, v. 254(1), p. 43-47.
36. Yu H., Iver R.K., Kern R.M., Cederbaum S.D. J. Neurosci. Res., 2001, v. 66, No 3, p. 406-422.
37. Zhu M-Y., Wang W-P., Regunathan S., Ordway G. Eur J Neurosci., 2008, v. 27(6), p. 1320-1332.

Вопросы, ответы, комментарии