Полиморфизм с677т гена метилентетрагидрофолат редуктазы при различных нозологических формах врожденных пороков развития

Введение

Врожденные пороки развития - аномалии развития, совокупность отклонений от нормального строения организма, возникающих в процессе внутриутробного или, реже, послеродового развития [2,4,7,9,10,16]. Пороки развития возникают под действием разнообразных внутренних (наследственность, гормональные нарушения, биологическая неполноценность половых клеток и др.) и внешних (ионизирующее облучение, вирусная инфекция, недостаток кислорода, воздействие некоторых химических веществ) факторов [2,3,4,7,9,10,16]. Со второй половины XX века во всех странах, особенно в развитых странах отмечается значительное учащение пороков развития [1,5,6, 8,11,12,13,14,15].

Цель исследования: изучение носительства Т аллеля полиморфного варианта С677Т гена MTHFR при различных формах врожденных пороков развития новорожденных и плодов.

Материал и методы исследования

Для верификации диагноза использовались следующие диагностические системы: Лондонская база данных «LDDB», австралийская система «POSSUM»-Pictures of Standard Syndromes and Undiagnosed Malformations, российская система «ДИАГЕН». Для пренатального выявления ВПР и хромосомных аномалий применяли ультразвуковое обследование (УЗ- аппараты “Toshiba 340” и “General Elektriks, USA”) в скрининговые сроки 10-14 и 20-24 недель беременности с заполнением для каждого срока соответствующих протоколов, а также инвазивные методы: амниоцентез с аспирацией ворсин хориона. Материалом для изучения распространенности полиморфного варианта С667Т в гене MTHFR, послужили образцы ДНК, полученные у женщин, родивших ребенка (плод) с ВПР (анэнцефалия, спинномозговая грыжа, неклассифицированные комплексы МВПР, трисомия 18 и 21). Во всех случаях диагноз врожденного порока развития был установлен врачом-генетиком, хромосомная патология подтверждалась цитогенетически, а в случаях летального исхода патологоанатомическим исследованием. В качестве контрольной группы послужили образцы крови 124 женщин, родивших двух и более здоровых детей без отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза.

ДНК выделяли из 1000мкл образцов периферической крови, анализ полиморфного варианта С677Т гена MTHFR проводился с использованием диагностического набора праймеров и рестриктаз производства НПФ “Литех” (Москва). Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили с помощью набора для выделения ДНК - “ДНК-экспресс-кровь” производства НПФ “Литех” (Москва), согласно инструкции производителя. В пробирку типа «Эппен- дорф» с замком переносили 1000мкл цельной крови и центрифугировали со скоростью 700g при комнатной температуре в течение 5 мин. После центрифугирования кровь разделяется на плазму и форменные элементы. На поверхности осадка форменных элементов расположен тонкий слой лейкоцитов. Пипеткой аккуратно удаляли плазму, не захватывая при этом лейкоциты, пробирку помещали в морозильник в течение 1 часа, затем полностью размораживали при комнатной температуре. Добавляли равный обьем реагента “ДНК-экспресс-кровь” и в течение 10 секунд интенсивно перемешивали на вортексе, затем инкубировали в термостате (15 мин, при 98°С). После этого образцы центрифугировали на микроцентрифуге со скоростью 10000g при комнатной температуре в течение 15 сек. Полученный таким образом супернатант использовали в качестве исследуемого образца ДНК. Тестирование полиморфизма гена ме- тилентетрагидрофолатредуктазы МТИБЯ в позиции С677Т (Л223У) проводили используя тест-систему производства НПФ “Литех” (Москва), согласно инструкции производителя. После приготовления рабочих амплификационных смесей добавляли по 5мкл образца ДНК в пробирки соответственно с рабочей амплификационной смесью “Норма” и “Патология” и переносили в термоциклер производства “Воесо” (Германия). Полимеразную цепную реакцию проводили в следующем режиме: 1-93°С, 1 мин.; 2 - 93°С, 30 сек.; 3-64°С, 30 сек.; 4-72°С, 30 сек.; 5-72°С, 1 мин. Циклы 2, 3 и 4 повторяли 35 раз. Электрофорез продуктов амплификации проводили в 3% агарозном геле. Гель окрашивали в растворе этидиум бромида и визуализировали при помощи ультрафиолетового трансиллюминатора.

Результаты исследования и их обсуждение

Имея ввиду, что одним из генетических факторов, предрасполагающих к формированию ВПР у по-томства, является носительство Т аллеля полиморфного варианта С677Т гена MTHFR, нами было изучены полиморфизм С677Т генаМТИЕЯ при различных нозологических формах врожденных пороков развития. Для установления диапазона концентраций гомоцистеина ИСУ нами было проведено количественное распределение случайной выборки сывороток крови пациентов, направленных в лабораторию “Диаген Плюс” на ежегодное профилактическое обследование (общий анализ крови и мочи) по содержанию гомоцистеина (ИСУ), (К - 82, возраст 22-48 лет, 36 мужчин, 46 женщин, показатели общего анализа крови и мочи в норме). Полученные данные приведены в табл. 1.

Таблица 1. Диапазон концентраций НСУ (нг/мл)

В табл. 2 приведены результаты тестирования гомоцистеина (ИСУ) в сыворотке крови пациентов лаборатории “Диаген Плюс” за период 01.04.2009 - 30.11.2010 гг. (К - 512). 

Таблица 2. Количественное распределение обследованных пациентов по содержанию НСУ в сыворотке крови

Особый интерес представляет выявленная нами зависимость между частотой полиморфизма в позиции С677Т (Л223У) гена метилентетрагидрофола- тредуктазы (МТИБЯ) от уровня содержания гомо- цистеина. В табл. 3 приведены распределения поли-морфизма в позиции С677Т (Л223У) гена метилен- тетрагидрофолатредуктазы (МТЫБЯ) среди 512 об-следованных пациентов на содержание гомоцистеи- на. Как показывает анализ полученных данных, при уровне концентраций ИСУ 5-15 нг/мл частота пациентов гетерозиготности мутантный гетерозиготный /СТ/ самая высокая и составляет около 47,0%, тогда как частота гомозиготности мутантного гомозиготного генотипа /ТТ/ увеличивается с высокой концентрации ИСУ 21нн/мл и более. С целью определения клинико-диагностической значимости полиморфизма С677Т гена MTHFR на территории Армении были определены частоты генотипов по данному полиморфизму в 3-х группах матерей, родивших детей с различными формами врожденных пороков в сравнении с группой контроля. Частота генотипов полиморфного варианта С677Т гена MTHFR у женщин, родивших детей с дефектом невральной трубки / ДНТ/,/МВПР/ и хромосомной аномалией в сравнении с контрольной группой, приведены в табл. 3. 

Таблица 3. Изучение распределения полиморфизма в позиции C677T (А223 V) гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) среди обследованных на содержание гомоцистеина

Таблица 4. Количественное распределение по содержанию в сыворотке крови НСУ в зависимости от полиморфизма гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) в позиции С677Т (A223V)

*СС — нормальный гомозиготный генотип; СТ — мутантный гетерозиготный генотип; ТТ — мутантный гомозиготный генотип

Таблица 5. Частота генотипов полиморфного варианта С677Т гена MTHFR у женщин родивших детей с ВПР и хромосомной аномалией

Примечание: * - р‹0,001, ДНТ — дефекты невральной трубки, МВПР — множественные врожденные пороки развития, ХА — хромосомные аномалии

Количественное распределение по содержа- лиморфизма гена метилентетрагидрофолатредукнию в сыворотке крови ИСУ в зависимости от по- тазы (МТИБЯ) в позиции С677Т (Л223У) приведено в табл. 4. В табл. 5 приведена частота генотипов полиморфного варианта С677Т гена MTHFR у женщин армянской популяции, родивших детей с ДНТ, МВПР и хромосомной аномалией в сравнении с контрольной группой. Установлено, что более высокая частота генотипа ТТ зарегистрирована в сравнении с группой контроля.

Установлено, что более высокая частота генотипа ТТ зарегистрирована в III и I группах женщин, ро-дивших ребёнка с хромосомной аномалией (23,0%) и ДНТ (13,3%), а генотип СТ распределен в группах I,II и III (соответственно 56,7%; 52,6% и 41,1%). Таким образом, полученные данные показывают, что в I группе, статистически достоверно чаще встречались генотипы СТ и СС по сравнению с контрольной группой IV. Во II группе преобладало гетерозиготное носительство (СТ), а в III группе матерей - гомозиготное (ТТ). Частота Т аллеля исследуемого полиморфного варианта также была значительно выше в группах матерей с ДНТ, ХА и МВПР, чем среди матерей группы контроля.

Полученные результаты подтверждают важную этиологическую роль изученного полиморфизма при формировании ВПР на территории Армении, что может быть использован как прогностический тест в проспективном медико-генетическом консультировании.

Заключение

1. Одним из генетических факторов, предрасполагающих к формированию ВПР у потомства, является носительство Т аллеля полиморфного варианта С677Т гена MTHFR.
2. На оснавании полученных данных установлено, что частота генотипов полиморфного варианта С677Т гена MTHFR у женщин, родивших детей с дефектом невральной трубки /ДНТ/, множественные врожденные пороки развития /МВПР/ и хромосомной аномалией /ХА/ почти в 3 раза выше по сравнению с контрольной группой /популяцией/.

Список литературы 

1. Барашнев Ю.И., Бахарев В.А., Новиков П.В. Диагностика и лечение врожденных и наследственных забо-леваний у детей. М 2004; 356-381.
2. 3урабян Н.П. Медико-генетическое консультирование болезни Дауна. Журн. экспер. и клин. медицины. 1986. Т. 26, 5. с. 488-491.
3. Кротова Л.И., Назаров И.А., Прокофьев Г.В. и др. Акушерско-гинекологический анамнез женщин, ро-дивших детей со спинномозговой грыжей. Акуш. и ги- нек. 1979. 9. с.56.
4. Курвинен Э.В. Факторы риска рождения ребёнка с врождёнными пороками развития и ультразвуковая пренатальная диагностика. Мед. генетика. 2006. с. 1020.
5. Лукьянова Е.М. Современные возможности пренатальной диагностики врождённой патологии плода. Перинат. та педiатр. 2002. 1. с. 5-7.
6. Минков И.П., Иордан Е.А., Минкова Л.В. Акушерский анамнез женщин и состояние их здоровья в период беременности плодом с пороками развития. Материн. и детство. 1992. 37,4-5. с. 36.
7. Мороз М.Г., Минкова Л.В., Сочинский А.В., Минков А.И. Акушерско-генетические факторы риска врождённых пороков развития плода и показания к пренатальной допплерэхокардиографии. Новые технологии в акуш, и гинек. Матер. научн. форума. М., 1999. с. 240-241.
8. Патютко Р.С. Течение беременности при болезни Дауна у плода. Генетика. 1972. 8, 3. с.144-147.
9. Резник Б.Я., Запорожан В.Н., Минков И.П. Врожденные пороки развития у детей. Одесса: АО БАХВА,2009.448 с.
10. Ромеро Р., Пилу Д., Дженти Ф. и др. Пренатальная диагностика врождённых пороков развития плода. Пер. с англ. М.В. Медведева. М.: Медицина, 2002, 502 с.
11. Сопко Н.И., Задорожная Т.Д., Арчакова Т.Н. Опыт дородовой диагностики врождённых пороков развития плода и плаценты у беременных женщин группы высокого риска. Здоровье женщины. 2001. 4. с. 89-93.
12. Чернозубова Н.Ю. Анализ акушерского анамнеза и клинико-инструментальных данных у детей с врождёнными кардиомиопатиями. Тез. докл. юбилейной науч. студ. конф. Омск, 1995. с. 82.
13. Antasakis А., Papantoniou N., Loukopouloe D., Kaskare- lis D. Prenatal diagnosis of twin pregnancies by double simultaneus fetoskopy. Prenat. Diagn. 2003. 3. P. 21-27.
14. Cordero J. Finding the causes of birth defects. New. Engl. J. Med. 2004. Vol. 331, 1. P. 48-49.
15. Stoll C., Alembic Y., Dott B., Rott M.P. Study of Down syndrome in 238992 consecutive births. Amer. Genet. 2008 Vol. 41, 1. P. 44-51.
16. Tannirandorm Y, Promchainant C., Romyanan O. et al. First trimester prenatal diagnosis by transcervical chori-onic villus sampling using curved biopsy forceps: lessons of the first 30 continuing pregnancies. J. Med. Assoc. Thai. 2006. Vol. 79, 8. P. 491-496.

Вопросы, ответы, комментарии