Сравнительное исследование мозжечкового торможения активности нейронов ядра дейтерса в норме и в условиях односторонней лабиринтэктомии у крыс

Введение

В последнее десятилетие, в связи с увеличением нейродегенеративных заболеваний, все большее значение в синхронизации работы нервных сетей придается взаимодействию нейромедиаторов, в особенности, между глутамати ГАМК-ергической системами. В частности полагается, что в развивающейся и зрелой центральной вестибулярной системе ГАМК и глицин могут играть важную роль. В нейронах вестибулярных ядер установлена решающая роль событий, опосредованных ГАМК рецептором, при восстановлении функции после ОЛ, известном в качестве вестибулярной компенсации (ВК) [1-5]. В свою очередь, с участием мозжечка осуществляются механизмы тормозной регуляции активности нейронов вестибулярной системы в норме и в условиях ВК, в то время как немозжечковые пути существенны для восстановления собственно стабилизации зрительной ориентации в течение движения, направленного к стороне контралатеральной к повреждению [6]. Изучение вовлечения экспрессии молекул в клетках Пуркинье после односторонней лабиринтэктомии (ОЛ) показало, что глутамат- ный рецептор delta-2 помогает восстановлению и поддержанию активностей ВН на стороне повреждения [7]. Теми же авторами было установлено, что ВК состоит из двух частей: торможения активности контралатеральных ВН в острой стадии после ОЛ и вос-становления и поддержания спонтанной активности таковых ипсилатеральных - в хронической стадии. Были предложены следующие гипотезы: 1) в острой стадии активированные нейроны с ипсилатеральной стороны проецируют свои аксоны в флоккулус для торможения контралатеральных нейронов через NMDA рецепторы, NO и/или ГАМКом - опосредованные сигналы, содействуя восстановлению межвестибулярного баланса; 2) в хронической стадии после ОЛ флоккулус подавляет тормозные эффекты на ипсилатеральных ВН через протеин-фосфатазу 2А, протеин киназу С и глутаматный рецептор дельта-2, с целью оказания помощи восстановлению и поддержанию активностей ипсилатеральных ВН [8]. Более того, в ребаланс спонтанной активности покоя между ипси- и контра- ВН в процессе ВК имеют вклад как повышение экспрессии KA2 mRNA в ипси-флоккулусе, так и понижение экспрессии mGluR1 mRNA в контра-флоккулусе, что может привести к эффекту редукции торможения клетками Пуркинье ипсилатеральных ВН [9]. Причем, ипсилатеральная флоккулотомия предотвращала компенсаторное повышение возбудимости, в норме встречающееся в деафферентированных ВН 4 часа спустя по-сле ОЛ, но не предотвращала одновременно встреча-ющуюся в этих нейронах даун-регуляцию эффектив-ности ГАМК рецепторов. Продемонстрировано далее, что повышение собственной возбудимости ВН в течение ВК является мозжечково-зависимым и тре-бует активации mGluR и протеин фосфориляции в мозжечковой коре [10]. Показано также, что в ранней стадии процесса ВК не вовлекается экспрессия субъединицы ГАМК(А) рецептора mRNA в флокку-лусе [11]. Представляет интерес, что непосредственно после ОЛ, в тесной корреляции с возникновением характерных окуломоторных и позных симптомов, показано значительное повышение высвобождения ГАМК в ипсилатеральных ВН, что не предотвраща-лось билатеральной флоккулоэктомией, указывая на гиперактивность комиссуральных тормозных нейронов. Спустя более 96 часов, с улучшением пове- денческихе симптомов, ипси-ГАМК уровни возвра-щались к норме, в то время как контра-ГАМК уровни значительно не изменялись в начальных стадиях ВК, но понижались в поздних (96 часов). Отмеченное свидетельствует о том, что разбалансированная комиссуральная тормозная система является основной причиной отдельных окуломоторных и позных симптомов унилатерального вестибулярного недостатка и что в течение ВК встречается ребаланс ко- миссурального торможения параллельно с последу-ющим поведенческим восстановлением [12]. Ранее, теми же авторами было показано, что гистаминерги- ческая модуляция высвобождения глицина и ГАМК содействует ребалансу нервной активности в ВН на поврежденной и интактной сторонах. Иными словами, имеет место облегчение ВК посредством гистаминергической и глицинергической модуляции высвобождения ГАМК в норме и патологии [13].

В настоящей статье представлены данные по сравнительному изучению мозжечкового торможения активности нейронов латерального вестибулярного ядра Дейтерса в норме и после ОЛ.

Материал и методы

В электрофизиологических исследованиях на крысах линии Альбино (230±30г.) производили экстраклеточную регистрацию спайковой активности 131 одиночных нейронов латерального вестибулярного  

Рис. 1. А, В, Д – перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху) и диаграммы частоты спайков с усредненными значениями (снизу), сконструированные на основе пре- и постстимульных депрессорных (А, В) и возбуждающих (Д) тетанических (ТД и ТП, соответственно) проявлений спайковой активности одиночных нейронов ЛВЯ на ВЧС 50 Гц и 100 Гц (в течение 1 сек) червя передней доли мозжечка в норме. Детальный анализ (Spike timing, кумулятивная гистограмма – Cumulative histogram и гистограмма частоты – Frequency histogram) двух произвольно избранных одиночных нейронов, представленных в А (Б) и В (Г). Здесь и на следующем рисунке: BE (before event), PE (post event) – значения до и после ВЧС, соответственно) и TT (time tetanization) – на время ВЧС или тетанизации; Df – разностная кривая.

ядра (ЛВЯ) Дейтерса при высокочастотной стимуляции (ВЧС) I-V долек червя мозжечка в норме (8 крыс) и спустя 3 дня после ОЛ (3 крысы). В остром эксперименте животных обездвиживали 1% дитил- лином (25 мг/кг в/б) и переводили на искусственное дыхание и после фиксации черепа в стереотак- сическом аппарате получали препарат изолированного головного мозга посредством дорсальной лами- нэктомии и трансекции спинного мозга (Т2-Т3) под местной новокаиновой анестезией. Все процедуры совершали согласно “принципам ухода за лаборатор-ными животными” (NIH publication № 85-23 revised 1985), а также специфическим правилам установленным для ухода за животными и используемыми нацинальным медицинским комитетом и службой здоровья. В стереотаксическом аппарате производили трепанацию черепа от брегмы до лямбды и вскрывали твердую мозговую оболочку. Стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика 1-2 μМ, заполненные 2М NaCI, вводили в ЛВЯ согласно стереотаксическим координатам [14] АР - 11.5, L ± 2.5, DV + 7 мм для регистрации спайковой активности одиночных нейронов. Осуществляли ВЧС червя мозжечка (прямоугольными толчками тока длительностью - 0.05 мс, амплитудой 0.12-0.18 мВ, силой тока 0.32 мА и частотой 50 и 100 Гц в течение 1сек). Стимулирующие и отводящие электроды вживляли согласно стереотаксическим координатам атласа крысы [13]: SO (АР - 1.3, L ±1.8, DV+ 9.4 mm); PV (АР - 1.8, L±0.6, DV+7.8mm), LVN (АР -11.5, L±2.5, DV+7.0 mm).

Рис. 2. Перистимульные гистограммы суммы спайков (сверху) и диаграмма частоты спайков (снизу) с усредненными значениями, сконструированные на основе пре- и постстимульных депрессорных (А) и возбуждающих (В) тетанических (ТД и ТП, соответственно) и посттетанических (ПТД и ПТП) проявлений спайковой активности одиночных нейронов ЛВЯ на ВЧС 50 Гц (в течение 1 сек) червя передней доли мозжечка в условиях ОЛ (3 дня спустя) на поврежденной стороне. Детальный анализ двух произвольно избранных одиночных нейронов, представленных в А (Б) и В (Г).

Постстимульная активность проявлялась в виде тетанической потенциации (ТП) и депрессии (TД),сопровождаемой посттетанической потенциацией (ПТП) и депрессией (ПТД). Оn-line регистрацию проводили на основе программы, предусматривающей селекцию спайков посредством амплитудной дискриминации. После селекции импульсный поток анализировался посредством специальной математической программы до и после стимуляции для получения растера пре- и постстимульного потока спайков одиночных нейронов в реальном времени. Использовали построения перистимульных гистограмм суммы спайков и усредненной частоты спайков, представленных в растере, перистимульных временных (peri event time histogram - PETH), кумулятивных гистограмм числа спайков с разностной кривой и гистограмм частоты с вычислением средней частоты спайков. Для избранных сравниваемых групп нейронального спайкинга конструировали сходные комплексные усредненные PETH (PETH Average), кумулятивные (Cumulative Average) и частоты (Frequency Average) гистограмм.Регистрацию производили с помощью специальной программы (разработчик В.С. Каменецкий). Анализ получен ных данных производили по специально разработанному алгоритму. Для определения статистической достоверности различий в длительности межспайковых интервалов до и после действия стимула использовался непараметрический критерий проверки однородности двух независимых выборок - двухвыборочный критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (Wilcoxon-Mann-Whitney test). Так как число регистрируемых спайков было достаточно велико (до нескольких сотен спайков за 10 секундный интервал после действия стимула), использовалась разновидность указанного теста, учитывающая его асимптотическую нормальность – z-тест. Сравнение критических значений с табличными значениями нормального распределения при уровнях значимости 0.05,0.01 и 0.001 (для различных испытаний), показывает, что в результате ВЧС для большинства выборок спайкинга нейрональной активности имеется статистически значимое изменение как минимум с уровнем значимости 0.05.

Результаты исследования

Исследовали постстимульные проявления возбудительной и тормозной активности нейронов ядра Дейтерса на интактных крысах (83 клетки) и таковых спустя 3 дня после ОЛ (48 клеток).

На рис. 1 представлены перистимульные гистограммы суммы спайков и диаграммы частоты спайков с усредненными значениями (А, В, Д) и детальный анализ потока спайковой активности (Б, Г) нейронов 

Рис. 3. Усредненные перистимульные (РЕТН Average), кумулятивные (Cumulative Average) и гистограммы частоты (Frequency Average) возбудительных, депрессорных и смешанных постстимульных проявлений активности нейронов ЛВЯ в норме и в условиях ОЛ (3 дня спустя) на поврежденной стороне при ВЧС (50 и 100 Гц, 1 сек).

ВЛЯ на стимуляцию червя передней доли мозжечка в норме с ТД (А-Г) и ТП (Д), сопровождаемые стационаризацией активности к концу испытаний. Представляет интерес факт большей выраженности и стабильности выявления ТД при 100 Гц ВЧС (В. Г). Наряду с этим следует отметить крайнюю скудность выявления ТП на ВЧС червя мозжечка (Д).

Следующий рис. 2 демонстрирует аналогичные эффекты спустя 3 дня после ОЛ при ВЧС (50 Гц) червя передней доли мозжечка с ТД (А) и ТП (В), сопровождаемыми ПТП в виде перистимульной гистограммы суммы спайков и диаграммы частоты спайков с усредненными значениями и детальным анализом постстимульных проявлений активности произвольно избранных нейронов ВЛЯ из числа представленных в А и В (Б, Г). Как видно из рисунка, имеет место еще большая выраженность ТД уже при 50 Гц, которая приближается к таковой в норме при 100 Гц. Здесь также крайне редко выявлялись ТП (В), как и в случае нормы.

Наконец, на рис. 3 показаны усредненные перистимульные, кумулятивные гистограммы частоты тормозных, возбудительных и смешанных постстимульных проявлений активности нейронов ЛВЯ в норме и в условиях ОЛ на поврежденной стороне при ВЧС (50 и 100 Гц, 1 сек). Ясно просматривается фактически двукратное углубление ТД, сопровождаемое ПТП в случае ОЛ (Группа Б) по сравнению с нормой (группы В, Г), а также редкие эффекты ТП (Группа А).

Обсуждение результатов

Согласно программному математическому анализу импульсной активности в нейронах лате-рального вестибулярного ядра Дейтерса на высоко-частотную стимуляцию (ВЧС) 1-У долек червя моз-жечка в настоящем изучении выявлены преимуще-ственно тормозные проявления активности (тетани- ческая депрессия - ТД) у интактных крыс, лучше вы-раженные при 100 Гц. На 3 день после односторон-ней лабиринтэктомии (ОЛ) уже при ВЧС 50 Гц мозжечка имело место ТД нейронов ядра Дейтерса, ана-логичное таковому при 100 Гц у интактных крыс, но двукратно более выраженное и сопровождаемое, как правило, поттетаническими тормозными и возбуди-тельными эффектами (посттетаническая депрессия -ПТД и потенциация - ПТП). В обоих случаях из-редка выявляли тетаническую потенциацию (ТП) с стационаризацией активности в норме, а после ОЛ, сопровождаемую ПТП. Иными словами, в условиях ОЛ активность нейронов ядра Дейтерса на ВЧС мозжечка характеризовалась углублением торможения и присоединением к тетаническим эффектам посттетанических проявлений активности, что указывает на компенсаторную активацию тормозных процессов при патологии.

В самое последнее время опубликован обзор, посвященный современным представлениям о сложной функции тормозных синапсов в ЦНС [15]. Многочисленные недавние изучения на клеточном и сетевом уровнях показывают, что синаптическое торможение не может обозреваться лишь в качестве противовеса синаптическому возбуждению. Торможение обслуживает дополнительно высоко специфические функции в нервной системе млекопитающих. На молекулярном и клеточном уровнях тормозные синапсы дают начало различным постсинаптическим реверсным потенциалам, кинетике, пластичности фармакологической модуляции [15]. Представляет интерес тот факт, что в некоторых системах в течение развития нервной системы ГАМК действует в качестве трофического фактора, влияющего на пролиферацию, миграцию, дифференциацию, созревание синапсов, клеточную гибель и экспрессию рецептора ГАМК(А) [16]. В частности, адаптивная регуляция функциональной эффективности ГАМК рецепторов в ВН может быть важным клеточным механизмом для гомеостаза би-латеральной возбудимости вестибулярных ядер [17]. В заключение, преимущественно тормозные изменения активности нейронов ядра Дейтерса в настоя-щем исследовании подтверждает их значимость в ка-честве регулирующих как в норме, так и патологии. Ранее нами были представлены данные по связям ЛВЯ с различными структурами мозга, причем большинство из них, как правило, тормозило его, среди которых особое место принадлежало мозжечку [18]. Более того, протекторный эффект торможения также был показан нами при ОЛ, активированный в условиях фармакологической интервенции [19].

Список литературы 

1. Cameron SA, Dutia MB. Neuroreport. 1997. V. 8, № 11. P. 2595-2599.
2. Yamanaka T, Him A, Cameron SA, Dutia MB. J Physiol.2000.V. 523, Pt 2, P. 413-424.
3. Johnston A.R., Him A., Dutia M.B. Neuroreport 2001, V.12,P. 597-600.
4. Tighilet B. and Lacour M. Eur. J. Neurosci. 2001. V. 13, P. 2255-2267.
5. Giardino L., Zanni M., Pignataro O., Calza L. Brain Res. 2002. V. 929, № 1, P. 76-86.
6. Beraneck M., McKee J.L., Aleisa M., Cullen K.E. J Neu-rophysiol. 2008. V 100, № 2, P. 945-958.
7. Kitahara T, Takeda N, Okumura S, Kubo T. Nippon Jibi- inkoka Gakkai Kaiho. 1998a. V. 101, № 1, P. 37-43.
8. Kitahara T, Takeda N, Kiyama H, Kubo T. J. Neurophysiol. 1998. V. 80, № 5, P. 2352-2367.
9. Horii A, Smith PF, Darlington CL. Brain Res. 2001. V. 139, №, P. 188-200.
10. Johnston AR, Seckl JR, Dutia MB. J. Physiol. 2002. V. 545, Pt. 3, P. 903-911.
11. Yu Q, Kong W. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi.2005.V. 19, № 20, P. 939-941.
12. Bergquist FB, Ludwig M, Dutia MB. J. Physiol. 2008. V. 586, Pt 18, P. 4441-4452.
13. Bergquist F., Ruthven A., Ludwig M., Dutia M. J. Physiol.2006.V. 577, Pt. 3, P. 857-868.
14. Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 5th edn. Acad. Press, New York, p. 367.
15. Birke G, Draguhn A. Pharmacopsychiatry 2010. 43, Sup- pl.1, S. 21-31.
16. Owens D.F., Kriegstein AR. Neuroscience 2002. № 9, V.3,P. 715-727.
17. Yamanaka T, Him A, Cameron SA, Dutia MB. J Physiol.2000.V. 523, Pt 2, P. 413-424.
18. Sarkisian VH. Arch. Ital. Biol. 2000. V 138, P. 295-353.
19. Galoyan A.A., Khalaji N., Hambardzumyan L.E., Ma- nukyan L.P., Meliksetyan I.B., Chavushyan V.A., Sarki-sian V.H., Sarkissian J.S. Neurochem. Res. 2010. V 35, P. 1747-1760.

Вопросы, ответы, комментарии