Ассоциирование богатого пролином полипептида с двумя изоформами цитохрома b558 из клеток опухолевой ткани лимфосаркомы человека

Активные формы кислорода (АФК), которые при повышенных концентрациях на клеточном уровне проявляют токсическое воздейстие и являются вторичными мессенджерами транскрипции различных генов, обеспечивающих выживаемость и пролиферацию нормальных и опухолевых клеток. Следовательно, опухолевые клетки, имеюшие низкие уровни антиоксидантных систем, при повышении активности последних экзогенными антиоксидантами наблюдается снижение процесса опухолеобразования [1]. Источниками образования АФК в опухолевых клетках также является КАБРИ оксидаза. Активность продуцирования О2 в этих клетках выше, по сравнению с нормальными клетками, и эти О_2¯ регулируют рост и транскрипцию генов опухолевых клеток меланомы. При этом ингибитор КАБРИ оксидазы - дифенилен йодиниум, снижает рост и транскрипцию генов опухолевых клеток [2].

Путем изменения уровня КАБРИ оксидазы (Кох) иммунохимическим методом, с использованием антигенов против цитохрома Ь558, осуществляется подавление активности КАБРИ оксидазы, в результате чего стимулируется дифференциация опухолевых клеток меланомы [3]. Также у пациентов иммуннохимическим методом, с использованием антигенов против цитохрома b₅₅₈  был определен уровень цитохрома b₅₅₈ в опухолевых клетках лимфатических узлов [4]. При этом, на поверхности лимфоцитов периферической крови, наблюдается экспрессия цитохрома b₅₅₈ [5]. Под влиянием супероксидов, продуцируемых супероксидпродуцирующим липопротеином сыворотки плацентарной крови женщин - супролом, как результат окислительно-восстановительных процессов в опухолевых клетках с участием О_2¯, наблюдается подавление роста опухолевых клеток лимфосаркомы Плисса и повышение числа лейкоцитов со стимулированием пролиферации в культуре клеток [6]. Под влиянием ретиновой кислоты и куркумина наблюдается увеличение (до 4-х раз) О_2¯ -продуцируюшей активности и937 лейкемических клеток человека. При этом, как показывают иммунохимические анализы, уровни цитозолевых изоформ цитохрома b₅₅₈ - р47 рhох и р67 рЬох повышаются в 7 и 4 раза соответственно, по сравнению с показателями при отсут-ствии ретиновой кислоты [7]. Было показано и подтверждено недавно, что фагоцитарные цитозолевые изоформы цитохрома b₅₅₈ - р22рhох и р47рhох, в со-ставе КАБРИ оксидазы, состоят из 390 аминокислот с тремя функциональными доменами (domines), в частности, богатого пролином домена (РRR) [8, 9].

Методом иммунно-афинной хроматографии из фагоцитов человека получен очищенный гетеродимерный мембранный белок цитохром b [10]. К насто-ящему времени из клеток опухолевой ткани челове-ка, в частности лимфосаркомы, фракция изоформ цитохрома b₅₅₈ еще не выделена. Однако приведенные методы (иммунно-химические и др.) определения уровней и активностей цитохрома b₅₅₈ из нормальных и атипичных (опухолевых) клеток практически неудобны для выявления новых характеристик цитохро-ма b₅₅₈ не только из нормальных, но и клеток опухолевой ткани (лимфосаркома человека). Разработка простого кратковременного аналитического и препаративного метода получения фракции изоформ цитохрома b₅₅₈ из клеток опухолевой ткани (лимфосаркома человека) становится актуальной, т.к. это дает возможность определения следующих факторов.

1. Оптико-спектральных показателей изоформ цитохрома b₅₅₈ кислого характера.
2. КАБРИ-зависимой О_2¯ -продуцирующей активности этих цитохромов b₅₅₈ [11].
3. ФерриИЬ-восстанавливающей активности вышеуказанных гемопротеинов [12].
4. Влияние синтетического аналога из нейросекреторных гранул гипоталамуса - богатого пролином полипептида (БПП-1) [15] на эти активности.
5. Определение явления ассоциации БПП-1 (БПП-1обладает антистрессорным и антиопухолевым эффектами, хотя механизмы этих явлений еще не выявлены [13]) с цитохромом b₅₅₈ из этих клеток опухолевой ткани.

Определение этих биохимических факторов и явилось целью проведения данного исследования.

Материал и методы

1. Выделение фракции цитохрома b₅₅₈ кислого характера из клеток опухолевой ткани лимфосаркомы человека

Свеженабранная опухолевая ткань лимфосаркомы (из подмышек) человека подкожной локализации (с давностью заболевания 3-4года) была очищена от жировых остатков промыванием, сначала физиологическим раствором, а затем водой (1/50об/об) и после удаления следов воды была взвешена (по 10г). Гомогенизацию опухолевой ткани осуществляли в 0,25М растворе сахарозы (50 мл) при 4^о, со скоростью вра-щения ножей 1000об/мин в течение 1мин.

Выделение фракции цит b₅₅₈ кислого характера из гомогената опухолевой ткани осуществляли лицензированным способом [14], с небольшим измене-нием, которое связано с изменением угловой скорости вращения ножей для полной гомогенизации опухолевой ткани. После центрифугирования гомогената (10 000об/мин, 20мин) осадок повторно гомогенизировали в воде (1:100об/об) и после центрифугирования гомогената в аналогичном режиме осадок промывали водой (1:1000об/об) и окончательно собира-ли последующим ценрифугированием. После сме-шивания осадка с водой (1:10об/об) и гомогенизации осуществили процесс солюбилизации суммарной фракции цит b₅₅₈ [14]. После диализа раствора цит b₅₅₈ против воды и центрифугирования при 13 000об/ мин в течение 20мин супернатант подвергали ионобменной хроматографии на колонке с целлюлозой КМ-52 (уравновешенной 0,002М калий-фосфатным буфером, рН-7,4) для удаления следов гемоглобина и других белков основного характера. Не задержавшуюся на КМ-52 фракцию цит b₅₅₈ далее подвергали ионобменной хроматографии на колонке с целлюлозой DE-52. Из последней колонки фракцию цит b₅₅₈ ислого характера элюировали 0,2М калийфосфатным буфером (КФБ). Далее эту фракцию подвергали гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100 (superfine) размерами 4x90см.

2.Определение молекулярной массы изоформ цит b₅₅₈ кислого характера из клеток лимфосаркомы

Молекулярную массу изоформ цит b₅₅₈ кислого характера определяли методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100 (superfine), используя в качестве стандартов следующие белки: цитохром С из сердца быка, CuZn-СОД из печени быка, церуло- плазмин из сыворотки плацентарной крови женщин, каталазу из печени быка. Был использован также декстран синий для определения свободного объема сефадекса.

3.Определение NADPH-зависимой О_2¯ - продуци-рующей активности изоформ цитохрома b₅₅₈ кислого характера из клеток лимфосаркомы

NADPH-зависимую O_2¯  -продуцирующую активность изоформ цитохрома b₅₅₈ определяли методом нитротетразолиевого синего (НТС) путем вычис-ления процента повышения образования формазана (при 560нм) в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. К реакционной смеси (по 3,0мл) добавляли дополнительно 5х10^-4М NADPNa2 [11](1,2 -2мл, цит b₅₅₈ является NADPH-зависимым O_2¯ -продуцирующим гемопротеином) и 0.2мл цит b₅₅₈ (с А₅₃₀=0,2). За единицу 02 -продуцирующей активности цит b₅₅₈ принимали количество белка, стимулирующее образование формазана на 50%. Удельная O_2¯ -продуцирующая активность изоформ цит b₅₅₈ клеток лимфосаркомы была рассчитана на 1 г ткани.

4.Определение ферриНb-восстанавливающей активности изоформ цит b₅₅₈ кислого характера из клеток лимфосаркомы

ФерриНb-восстанавливающую активность цит b₅₅₈ определяли, учитывая, что при аэробной инку-бации цит b₅₅₈ и ферриНb in vitro происходит восстановление ферриНЬ (Fe⁺³-Hb) до ферроНb (Fe⁺²-Hb) [12]. Был использован электрофоретически гомогенный ферриHb из эритроцитов человека. К 3мл ферриИЬ (с А₅₆₅=0,9) добавляли цит b₅₅₈ кислого характера из приведенных источников (по 0.1мл с А₅₃₀=0,3) и без перемешивания реакционной смеси инкубировали ее при 36о в течение 5-6ч. Далее регистрировали кинетику снижения плотности оптического поглощения ферриHb (при 565нм). Постепенное восстановление ферриHb до ферроИЬ сопровождается снижением плотности а-поглощения ферриHb (при 565нм), которое прямо пропорционально образованию ферроHb (при 555нм). За единицу ферриHb-восстанавливающей активности принимается количество цит b₅₅₈  вызывающее снижение плотности а-поглощения ферриHb до 0,05 в течение 30мин при 36^о.

5.Влияние БПП-1 на NADPH-зависимую О_2¯ - продуцирующую и ферриHb-восстанавливающую активности изоформ цит b₅₅₈ ислого характера из клеток лимфосаркомы

БПП-1 (5мкг) инкубируется в течение часа с изоформами (по 3мл) цит b₅₅₈ кислого характера из клеток лимфосаркомы при 36^о, затем определяются КАБРИ-зависимая О_2¯ -продуцирующая и ферриHb- восстанавливающая активности изоформ цит b₅₅₈ до и после гель-фильтрации этих цит b₅₅₈ на колонке с сефадексом 0-25 (2х70см) при 4^о (объем разбавленного раствора цит b₅₅₈ после гель-фильтрации уменьшаем вакуумной откачкой до 3-х мл, т.к. до гель-фильтрации объем раствора составлял 3мл).

Оптические спектры поглощения регистрирова-лись на спектрофотометре 8ресоМ ИУ/УК (Германия) с длиной оптического пути 1см. В ходе работ были использованы центрифуги К-70 и К-24 (Германия). Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом ва-риационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности «Р».

Результаты и обсуждение

Из клеток тканей (по 10г) лимфосаркомы человека подкожной локализации и давностью заболевания 3-4года, по приведенному способу, выделяли суммарную фракцию цит b₅₅₈  которая из колонки с целлюлозой БЕ-52 элюируется 0.2М КФБ. Эта фракция цит b₅₅₈ имеет характерные для цит b₅₅₈ максимальные оптические поглощения и формы оптических спектров. В окисленном состоянии этот цит b₅₅₈ имеет максимальные поглощения: при 560нм (а-поглощение), 530нм β-поглощение), 412мн (γ-поглощение или поглощение Соре), а в восстанов-ленном дитионитом натрия состоянии - 518нм, 525 нм и 418 нм соответственно. После гель-фильтрации на сефадексе 0-100 суммарной фракции цит b₅₅₈ из клеток ткани лимфосаркомы получали изоформы цит Ь558 с повышенной молекулярной массой (цит b¹₅₅₈) до 95-100кДа и пониженной молекулярной массой (цит b²₅₅₈) 60-70кДа. Оптические спектры поглощения (УФ и видимой области) фракции этих цит b₅₅₈ кислого характера (с колонки с целлюлозой БЕ-52 также элюируется 0.2М КФБ) приведены на рис. 2. 

Оптический спектральный индекс (А₄₁₂/А₅₃₀) для цит b¹₅₅₈ составляет 7.5, а для цит b²₅₅₈ - 10.0 (рис. 1). С другой стороны, отношение А₂₈₀/А₄₁₂ для цит b¹₅₅₈ составляет 2.6, а для цит b² - 1.6 (рис. 2).

Рис.1. Oптические спектры поглощения изоформ цит b₅₅₈ кислого характера: а – с повыщенной (до 95-100 кДа), б –

пониженной (до 60-70 кДа), молекулярной массой; в окисленном (1) и восстановленном (2) состояниях.

Рис. 2. Оптические спектры поглощения цит b¹₅₅₈ (а) и цит b²₅₅₈ (б) из клеток опухолевой ткани лимфосаркомы человека.

Плотность оптического поглощения (А₅₃₀ ), полученной водорастворимой суммарной фракции цит b₅₅₈ (15 мл), составляет 0.22 (эта фракция получена из клеток 10г ткани лимфосаркомы). После гель-фильтрации этой фракции на колонке с сефадексом 0-100 и концентрации на колонке с целлюлозой ЭЕ-52 (уравноешенной 0.002М КФБ) получали по 3мл фракции цит b¹₅₅₈ с А^о₅₃₀=0,20 и 6 мл цит b²₅₅₈ с А^о₅₃₀=0,24. Таким образом, в результате такой обработки на колонках с ЭЕ-52, КМ-52, 0-100 и повторно на ЭЕ-52 потеря цит Ь558 составляет около 30% (выход 70%).

Таким образом, из клеток тканей лимфосаркомы человека вышеприведенным способом [14] впервые получаются водорастворимые изоформы цит b₅₅₈ кислого характера с молекулярной массой 95-100 кДа и 60-70 кДа, которые несколько отличаются и по спектральным оптическим индексам.

NADPH-зависимая О_2¯ -продуцирующая актив-ность этих цитохромов b₅₅₈ повышается после их часовой инкубации с БПП-1. Эта активность практически не изменяется после гель-фильтрации этого инкубационного раствора цит b¹₅₅₈ с БПП-1на колонке сефадексом G-25 (рис.3а). Аналогичным образом повышается и NADPH-зависимая О₂¯-продуцирующая активность цит b²₅₅₈ после инкубации с БПП-1при таких же условиях и дальнейшей гель-фильтрации инкубационного раствора на сефадексе G-25 (рис.3б).

Рис.3. Фракции изоформ цит b¹₅₅₈  (а) и цит b2558 а – NADPH-зависимая О2¯-продуцирующая активность цит b¹₅₅₈  (1) после его часовой инкубации (по 0.2 мл,с А^о₅₃₀=0,20) с БПП-1 (5 мкг, 0,5 мл) при 36^о (2) и после гель-фильтрации b¹₅₅₈  с БПП-1 на сефадексе G-25 и концентрирования до прежнего объема (3). б – то жесамое для цит b²₅₅₈.

С другой стороны, БПП-1 повышает ферриHb-восстанавливающую активность цит b¹₅₅₈ и цит b²₅₅₈ при инкубировании БПП-1 (0.5мл, 5мкг). 3мл БПП-1инкубировали с цит b¹₅₅₈ и цит b²₅₅₈ с А^о₅₃₀=0.2 в течение часа при 36^о. Эта активность не понижается и после гель-фильтрации этого инкубационного раствора на сефадексе G-25 и концентрирования до объема белка, бывшего до процесса гель-фильтрации (рис. 4а,б).

Рис.4. ФерриHb-восстанавливающая активность фракции изоформ цит b₅₅₈ (цит b¹₅₅₈ и цит b²₅₅₈  из клеток ткани лимфосаркомы человека: а — ферриHb- восстанавливающая активность цит Ь!558 (1) I и после инкубации последнего (0.2 мл, с Ао530=0,20) с 0,5 мл БПП-1 (5 мкг) при 36^о (2) и после гель-фильтрации смеси на сефадексе 0-25 (3). б — то же самое для цит b²₅₅₈.

Таким образом, БПП-1 активирует как КЛЭРЫ- зависимую О_2¯ -продуцирующую, так и ферриHb- восстанавливающую активности. Можно заключить, что из клеток опухолевой ткани (лимфосаркома) че-ловека, с использованием лицензированного способа, впервые выделены фракции изоформ цит b₅₅₈ кислого характера 2-х типов (цит  b¹₅₅₈ и цит b²₅₅₈  с молекулярными массами 95-100 кДа и 60-70 кДа. В процессе применялись методы ионобменной хроматографии на целлюлозах КМ-52 и DЕ-52. Эти цит  b¹₅₅₈ и цит  b²₅₅₈ обладают как NADPH-зависимой О_2¯ -продуцирующей, так и ферриHb-восстанавливающей активностями.

Факт практической неизменности вышеназванных активностей изоформ b₅₅₈ под влиянием БПП-1,после гель-фильтрации на сефадексе 0-25 свидетельствует о том, что БПП-1 ассоцируется с изоформами цит b¹₅₅₈ и цит b²₅₅₈ из клеток опухолевой ткани (лимфосаркома) человека и связь цит b₅₅₈ с БПП-1 не расщепляется в результате гель-фильтрации. Это, в свою очередь, подтверждает гипотезу о том, что b₅₅₈ является рецептором БПП-1.

Возможно, ассоциацией с b₅₅₈ на поверхности опухолевых клеток, БПП-1, путем повышения КЛБРЫ-зависимой О_2¯ -продуцирующей и ферриHb- восстанавливающей активностей цит b₅₅₈  нарушает (повышает) окислительно-восстановительный статус опухолевых клеток и их кислородный гомеостаз, тем самым вызывая их гибель.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы МНТЦ А-1701.

Список литературы 

1. Oberley L.W. Biomed. Pharmacother., 2005, 59, 142-148.
2. Brar S.S., Kennedy T.P., Sturrock A.P. Am.J.Physiol.Cell Physiol., 2002, С.1212-С.1224.
3. Zhao Y., Liu J., McMartin K.E. Oncology reports, 2008,19, 1225-1230.
4. Shiota M., Moris S., Imajoh-Ohmi S., Nakamura M.Pathol.Res.Pract., 1993, 189(9), 985-991.
5. Kobayashi S., Imajoh-Ohmi S., Kuribayashi F., Nunoi H.,Nakamura M., Kanegasaki S. J.Biochem., 1995, 117(4),758-765.
6. Simonyan M.A., Karapetyan A.V.Galstian D.A., Simonyan R.M., Babayan M.A. Biochemistry (Moscow),1996, 61; 1578-1586.
7. Kikuchi H., Kuribayahsi F., Kiwaki N., Nakayama T.Biochem,Biophys.Res.Commun., 2010, 395(1), 61-65.
8. Ogura K., Nobuhisa I., Yuzawa S., Takeya R., Torikai S.,Saikawa K., Sumimoto H., Inagaki F. J.Biol.Chem., 2006,V.281, N.6, P. 3660 - 3668.
9. El-Benna J., Dang P.M., Gougerot-PocidaloM.A., Murie J.C., Brout-Bouche F. Exp.Mol.Med., 2009, 41(4), 217-225.
10. Taylor R.M., Jesaitis S.J. Methods Mol.Biol., 2007, 412,424-437.
11. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Бабаян М.А., Бабаян М.А., Симонян М.А., Галоян А.А. Мед. наука. Армении, 2003, Т. XLIII, N.1, С.30-34.
12. Simonyan G.M, Simonyan R.M., Simonyan M.A. Electronic J. of Natural Sci. NAS RA, 2006, 2(7), 3-6.
13. Симонян Г.М., Нерсесян А.К., Симонян Р.М. Нейрохимия, 2005, T.22, N.2, C.125–130.
14. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Способ получения цитохромов b558 из клеточных компонентов. Лицензия изобрет. Армпатента N А-2233. Ереван,2008.
15. Galoyan A.A. Brain neurosecretory cytokines: Immune response and neuronal survival. 2004, Klawer Academic plenum Publishers, N-Y., P.188.

Вопросы, ответы, комментарии