Костному матриксу (получение, стерилизация и консервация)

Среди разнообразных биологических имплантационных материалов, применяемых в костнопластической хирургии, широко используется деминерализованный костный матрикс (ДКМ). В отличие от других трансплантатов аллогенного или ксеногенного происхождения, ДКМ обладает ярко выраженной способностью вызывать остеогенез вне костного ложа [3,11,12]. По данным ряда авторов индуктивная активность костного матрикса при эктопической пересадке колеблется от 87,5 до 100% [4, 9, 11]. ДКМ после эктопической, ортотопической или гетеротопической имплантации, стимулирует регенерацию и значительно быстрее, по сравнению с другими видами консервированных трансплантатов, замещается новообразованной костной тканью [7, 8, 10].

В данной работе приведены результаты изучения времени деминерализации костей новорожденных поросят в различных концентрациях соляной кислоты, описаны два способа стерилизации и консервации деминерализованных костей новорожденных поросят (ДКНП). Среди известных способов приготовления трансплантационных материалов мы считали наиболее целесообразным проводить деминерализацию различными концентрациями соляной кислоты, что дает наилучшие результаты в плане костной индукции [6]. Для деминерализации рекомендуется использовать 0,6-3,6н раствор соляной кислоты. Необходимую концентрацию раствора соляной кислоты получали путем разведения выпускаемого промышленностью 35-37% раствора соляной кислоты (табл. 1).

В качестве донорского материала использовались теменные и лобные кости черепа, лучевые, локтевые, плечевые, малоберцовые, бедренные, большеберцовые кости, лопатки, подвздошные, седалищные кости новорожденных поросят, которые забирались сразу после декапитации (под эфирным наркозом). Изъятые кости очищались от мягких тканей, надкостницы и помещались в эфир для обезжирования, с последующей выдержкой в течение 2 часов.

Деминерализацию осуществляли в предложенном нами устройстве (рис. 1), которое состоит из микрокомпрессора и двух емкостей. В первой емкости осуществляли деминерализацию, а во второй - нейтрализацию паров кислоты, а также остатка кислоты в деминерализованных костях.

Методика состоит в следующем: первая емкость на уровне 4/6 заполняется 0,6н (можно использовать и другие концентрации раствора соляной кислоты), вторая емкость заполняется 0,1 М буферным раствором (фосфатный буфер рН 8) или 5% раствором натрия бикарбоната, также на уровне 4/6 и добавляли 1-2 капли раствора фенолфталеина.

Таблица 1 

Количество соляной кислоты, необходимое для приготовления 1000 мл 0,6-3,6 н раствора

Примечание: в табл. 1 расчеты сделаны для 37% раствора соляной кислоты, принимая раствор 37% соляной кислоты за 100%. 

Предварительно тщательно очищенные от мягких тканей кости новорожденного поросенка помещаем в рабочий раствор, в емкость, которая герметически закрывается, а затем включаем микрокомпрессор (1) (рис. 1). Воздух через соединительную трубку (2) и тройник (3) с распылителем на конце (4) подаем в герметичную закрытую емкость (5), в которой установлена цилиндрическая камера (6), разделенная сеткой (7) на 2 части (А, Б). В верхней части камеры (А) помещаем кости, а в нижней (Б) находится распылитель воздуха. Пузырьки воздуха, равномерно перемешивая рабочий раствор с парами последнего, через соединительную воздуховодную трубку (8) в крышке (9) подаем в емкость 10, внутреннее устройство которой идентично емкости 5. В буферном растворе пары рабочего раствора нейтрализуются, и чистый воздух через воздуховодную трубку (11) выходит наружу. 

а	б

 Рис. 1. а) Схема; б) Фото. Устройство для деминерализации костей плода.

1.Микрокомпрессор; 2.Соединительные трубки; З.Тройник; 4.Распылитель; 5.Емкость первая; б.Цилиндрическая камера; 7.Сетка; 8 и 11.Воздуховодная трубка; 9.Крышка; 10.Емкость вторая; 12, 13, 14.3ажимы; А - верхняя часть цилиндрической камеры; Б - нижняя часть цилиндрической камеры.

Во время деминерализации открываем зажимы(12) и (14) и закрываем зажим (13), температурный режим при деминерализации варьировал от +2°С до +4°С. Применение рекомендуемого устройства не только обеспечивает высокое качество деминерализации и нейтрализации костей, но и исключает возможность загрязнения окружающей среды парами соляной кислоты.

Скорость деминерализации зависел от концентрации соляной кислоты, а также - от толщины кости.Как видно из данных таблицы 2, наиболее быстро деминерализовались теменные и лобные кости черепа, лучевая, локтевая и малоберцовая кость и лопатки. 

О степени деминерализации судили путем скручивания кости, сгибания или прокола ее иглой (рис. 2). Полностью деминерализованная кость приобретала эластичность и гибкость. Степень деминерализации определяли также с помощью гистохимического анализа, рентгенографии и др. 

 Рис. 2. Деминерализованная кость новорожденного поросенка

После деминерализации кости извлекали из рабочего раствора, в течение 1,5 часа промывали проточной водой и затем помещали на час в 0,1 М буферный раствор (емкость 10) с целью нейтрализации. При этом закрывали зажимы 12 и 14 и открывали зажим 13. Затем деминерализованную кость снова промывали проточной водой, высушивали марлевыми салфетками и консервировали одним из известных способов.

Таблица 2

Время деминерализации костей поросенка в различных концентрациях соляной кислоты

Таким образом, продолжительность деминерализации костей новорожденных поросят зависел от концентрации соляной кислоты и от толщины кости. Мы считаем более целесообразным для деминерализации костей новорожденных поросят, применять 2,4-3,6 н соляную кислоту.

При проведении деминерализации костей в предложенном нами устройстве, заметно укорачивается продолжительность деминерализации.

Стерилизация и консервация деминерали-зованной кости новорожденных поросят

Стерилизацию и консервацию деминерализо-ванной кости новорожденных поросят проводили одновременно 0,25% раствором формалина с добавлением антибиотиков (мономицин, канамицин 0,5 г на 1 л) или при их отсутствии. Для получения 0,25% раствора формалина, 6 мл 40% раствора формалина добавляли к 994 мл физиологического раствора (рН раствора 7,3-7,4). Для приготовления 0,5% раствора формалина, брали 12 мл 40% формалина. Подавление роста микроорганизмов в 0,5% растворе формалина происходит через 5-7 суток [2, 5], в 0,25% растворе -через 10-12 суток. При использовании 0,5-0,25% формалина в отдельные сроки иногда наблюдали рост микрофлоры. Поэтому для большей надежности рекомендуется добавлять в эти растворы анти-биотики и антисептики (хлоргексидин, фуразолидон, диоксидин, мономицин и т.д.) [2,5]. Деминерализованные кости помещали в консервирующий раствор без соблюдения асептики.

Флаконы герметически закрывали и опечатывали парафином, датировали и нумеровали (рис.3). 

 Рис. 3 Расфасованный деминерализованный КМНП.

Температурный режим хранения деминерализованной кости - от +2°С до +4°С. При этих условиях обработанные кости хранились в течение 3-4 месяцев. Максимальный срок хранения костной ткани в слабом растворе формалина - 6 месяцев. Бактериологический контроль за качеством стерилизации проводили по общепринятым правилам.

С целью стерилизации деминерализованных костей новорожденных поросят мы использовали также рекомендуемой Л.И. Костандяном и А.М. Саркисяном [1] 0,25% раствор нашатырного спирта, который изготовляли следующим образом: к 2,5 мл нашатырного спирта (25%) (водный раствор аммиака) добавляют стерильный физиологический раствор до 1 л. Полученным раствором заливают уложенные в стерильные тары деминерализованные кости, которые держат 30-40 минут. Далее раствор сливают и деминерализованные кости заливают стерильным физиологическим раствором с добавлением антибиотика из расчета 1 мил-н ед. на 1 л на 30-40 минут. Приготовленные стерильные трансплантаты расфасовываются в стерильную посуду в стерильных условиях (в банке) и подвергаются консервации в морозильной камере бытового холодильника при температуре - 12°С.

Показания к применению: высокие остеоин- дуктивные свойства и антимикробная устойчивость КМНП позволяли использовать их в качестве индукторов остеогенеза и пластического материала при замещении дефектов лицевого скелета как в стационарной, так и в амбулаторной челюстно-лицевой хирургии.

КМНП рекомендуется применять при заполнении дефектов челюстей, образовавшихся после ци- стэктомии, удаления доброкачественных опухолей челюстных костей, секвестрэктомии, удаления ретинированных зубов, при альвеолитах, при коррекции альвеолярного отростка, замещении дефектов передней стенки гайморовой пазухи, при врожденных дефектах твердого неба, сегментарных дефектах нижней челюсти, при лечении заболеваний пародонта, околоапикальных воспалительных процессах и т.д. 

Список литературы

1. Костандян Л.И., Саркисян А.М. Способ химической стерилизации деминерализованных костных трансплантатов. (метод.рекоменд.). Ереван, 1987, 12с.
2. Парфентьева В.Ф., Эйнгорн А.Г., Разводовский В.Д. Консервация костной ткани в растворах формалина в слабых концентрациях (метод.письмо) ЦИТО.М., 1970, 12с.
3. Савельев В.И., Андрианов В.Л., Румянцев В.В. и др. Некоторые аспекты заготовки и применени . деминерализованных. костных. трансплантатов // Повреждения и заболевания опорнодвигательного аппарата. Л., 1982.-с.71-78.
4. Савельев В.И. Деминерализованная кость как особа . разновидность. костно-пластического. материала // Заготовка и пересадка деминерализованной костной ткани в эксперименте и клинике. Л., 1983.— с. 3-12.
5. Савельев В.И.Заготовка и консервация деминерализованных. костных. трансплантатов. (метод.. рекомендации).Л., 1984, - 14с.
6. Савельев В.И., Сысолятин П.Г., Тулупова И.Г. Деминерализованный. костный. трансплантат. и. его применение в стоматологии. Обзор литературы. Медицинский реферативный журн., разд. XII, 1987.- 9.— с.1-5.
7. Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки предшественники. М.,1973.
8. Jazayezi M.A., Wichter L.S., Zhou Z.Y. et al. Comparison of various delivery systems for demineralized bone matrix in rat cranial defect model//J. Craniofac. Surg., 1994, Jun. 5(3), 172178.
9. Linden G.T. Bone induction in implants of bone and dentine // J.Anat. 1975.— vol. 119.- 2.— p.359- 387.
10. Robie A.B., Deng Y.M., Samman W., Hagg U. The effect of demineralized bone matrix on the healing of intermembranous bone grafts in rabbit skull defects // J. Dent. Res.1996. Apr. 75(4): 1045 -51.
11. Urist M.R. Bone formation by autoinduction //Science.— 1965.-vol.150.-3698, p.893-899.
12. Urist M.R., Dowell T.A., Hay P.H., Stretes B.S. Inductive substrates for bone imformation. — Clin. Orthop., 1968, p.59-90. 

Вопросы, ответы, комментарии