Новые подходы в пренатальной диагностике хромосомных заболеваний

Цель исследования: Pазработка новых методических подходов в пренатальной диагностике хромосомных заболеваний плода на разных стадиях внутриутробного развития.

Материал и методы исследования: Aнализировано 1500 анкет беременных, направленных на медико-генетическое консультирование с отягощенным акушерским анамнезом, а также в связи с возрастом старше 35 лет. Всем беременным проводилось ультразвуковое исследование, определялись протеины РАРР-А и АФП в сыворотке крови. Иинвазивные методы пренатальной диагностики , такие как биопсия ворсинчатого хориона и амниоцентез проводились по показаниям. Цитогенетический анализ проводился с использованием молекулярно-цитогенетического метода FISH.

Результаты исследования: Ультразвуковые маркеры выявлены у 90 беременных (6%). Снижение уровня протеина РАРР-А нами выявлено у 30 беременных (2%). При этом у 3 женщин наблюдалось обратное соотношение уровней индивидуальных рисков в I и во II триместрах беременности. Инвазивными методами пренатальной диагностики выявлено 2 случая синдрома Дауна (за 2005- 2007)

Заключение: Скрининговое исследование крови беременных на протеин РАРР-А и АФП, а также скрининговое ультразвуковое исследование и применение инвазивных методов пренатальной диагностики с использованием классических  итогенетических методов и метода FISH позволяет определить хромосомную патологию.

Ключевые слова: Xромосомные заболевания плода, пренатальная диагностика.

Проблема врожденной и наследственной патологии за последнее десятилетие приобрела серьезную социальномедицинскую значимость. Это связано с тем, что возрос удельный вес врожденных пороков развития и наследственных болезней в структуре перинатальной и неонатальной заболеваемости и смертности. По данным Всемирной Организации  Здравоохранения 5% новорожденных появляются на свет с различными врожденными пороками развития и  наследственными заболеваниями. 40% детской смертности и такое же число спонтанных абортов обусловлены этой патологией.

Частота врожденных пороков развития и наследственных заболеваний влияет в большинстве случаев на показатель детской инвалидности. Врожденные пороки развития представляют собой серьезные препятствия мероприятиям по дальнейшему снижению перинатальной заболеваемости и смертности. Примерно 1% генетического груза приходится на генные мутации, 0,6% на хромосомные мутации, около 3-3,5% соответствуют болезням с наследственным компонентом (диабет, ишемическая болезнь сердца, некоторые опухоли и т.д.) [1].

Популяционная частота хромосомных заболеваний среди новорожденных составляет 0,6-0,8%, а у новорожденных с множественными врожденными пороками развития до 40% [2]. Лечение таких больных пока малоэффективно, и прогноз неблагоприятен. Поэтому в современных условиях необходима правильная и рационально организованная ранняя диагностика этой патологии, осуществляемая медико-генетическими консультациями, и в первую очередь, теми  подразделениями, которые обеспечивают пренатальную диагностику, позволяющую установить диагноз еще до рождения ребенка.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилась разработка новых методических подходов в пренатальной диагностике хромосомных заболеваний плода на разных стадиях внутриутробного развития.

Материал и методы

Методами пренатальной диагностики являются:

• скрининговое, динамическое (начиная с I триместра) ультразвуковое исследования беременных;
• скрининговое определение уровня протеина РАРР-А (pregnancy-association plasma protein- A), α-фетопротеина (АФП), хорионического гонадотропина (ХГ), неконъюгированного эстриола (НЭ) и других маркеров сыворотки крови матери;
• инвазивная пренатальная диагностика, включающая биопсию хориона, амниоцентез, кордоцентез.

В медико-генетической консультации Научноисследовательского центра охраны здоровья матери и ребенка нами анализировано 1500 анкет беременных с отягощенным акушерским анамнезом, а также в связи с возрастом старше 35 лет, направленных на медико-генетическое консультирование. Хотя удельный вес рожениц старше 35 лет составляет 5% от общего числа в популяции, более чем у 4% из них выявляются хромосомные патологии у плода, поэтому эта группа беременных заслуживает особого внимания как акушер-гинекологов, так и генетиков [4]. У этих беременных группы высокого риска проводилось глубокое изучение акушерско-гинекологического анамнеза, фенотипических данных, генеалогический анализ, исследование хромосомного набора супругов и определялся метод пренатальной диагностики, необходимый для каждого конкретного случая, для каждой конкретной беременной. Всем беременным проводилось ультразвуковое исследование, определялись протеины РАРР-А и АФП в сыворотке крови. Инвазивные методы  ренатальной диагностики, такие как биопсия ворсинчатого хориона и амниоцентез проводились по показаниям. Цитогенетический анализ проводился с использованием молекулярно-цитогенетического метода FISH.

Беременные старше 35 лет, у которых риск рождения детей с хромосомной патологией составляет 1:300 (у молодых беременных 1:1000), и, тем более, беременные старше 40 лет, у которых риск рождения детей с хромосомной патологией составляет 1:90, направляются на инвазивную диагностику независимо от показателей предварительного определения в сыворотке крови концентрации биохимических маркеров.

Результаты исследования и обсуждение

Общеизвестно, что частота хромосомной патологии выше у матерей, имеющих в анамнезе детей с хромосомными заболеваниями или врожденными пороками развития, а также у женщин с привычным невынашиванием на ранних сроках беременности. Индивидуальный риск рождения детей с хромосомной патологией наиболее высок у родителей, носителей хромосомных нарушений [8]. Прогностическая значимость данных анамнеза анализируется во многих работах и  еодинаково оценивается разными авторами [3, 4, 7]. Мы придерживаемся балльной оценки факторов риска, предложенной
нами в 1990г. [3].

Таким образом, медико-генетическое консультирование является первым шагом пренатальной диагностики врожденных пороков развития, в том числе хромосомных заболеваний.

Ультразвуковое исследование (УЗИ) имеет высокую информативность, является самым распространенным методом оценки состояния внутриутробного плода, который позволяет диагностировать 72,5% пороков развития, зафикцированных в регистре врожденных пороков развития г.Еревана. С помощью УЗИ в 20 недель беременности можно выявить до 20% хромосомных нарушений и около 40% трисомий по хромосоме 21 (при 8% ложноположительных результатов [7]. При синдроме Дауна часто обнаруживаются утолщенная (более 5 мм) шейная складка, внутриутробная задержка развития плода, отсутствие визуализации носовых костей, гидронефроз, укорочения бедренной кости, гиперэхогенный кишечник и пороки сердца. Увеличение воротникового пространства (3 мм и более) при сроке от 10 до 14 недель беременности является общим фенотипическим проявлением трисомий, синдрома Шерешевского-Тернера и триплодии и наблюдается
только у 5% плодов с нормальным кариотипом [6, 10].

Нами проведено ультразвуковое исследование 1500 беременных группы высокого риска, у которых ультразвуковые маркеры выявлены у 90 (6%), которым в дальнейшем проведено исследование РАРР-А и АФП, и предложены инвазивные методы пренатальной диагностики для уточнения диагноза. Протеин РАРР-А определялся нами на 8-14 неделе беременности в сыворотке крови матери у 1500 беременных группы высокого риска. АФП определялся нами в сыворотке крови матери у 1500 еременных группы высокого риска.

Пренатальный биохимический скрининг, который проводили в различных странах в 1996-1998 годах, показал, что выявляемость синдрома Дауна в I триместре беременности при одновременном определении концентраций протеина РАРР-А и ХГ, находится в диапазоне 55-68,5% при уровне ложноположительных результатов 5%. Эффективность изолированной оценки сывороточного содержания ХГ примерно вдвое ниже [11]. По данным Е.Casals и соавт. [9] она составила 9%, тогда как комбинированное исследование протеина РАРР-А и АФП позволило обнаружить 80% плодов с синдромом Дауна. Снижение уровня протеина РАРР-А нами выявлено у 30 (2%) беременных. При этом у 3 женщин наблюдалось обратное соотношение уровней индивидуальных рисков в I и во II триместрах беременности. Это указывает на целесообразность пренатального скрининга хромосомных заболеваний с помощью нескольких маркерных белков в различные сроки беременности. Во всех случаях предложены инвазивные методы пренатальной диагностики для уточнения диагноза.

Уже в настоящее время в Дании 10-12% беременных женщин подвергаются инвазивным диагностическим процедурам, что позволяет выявить пренатально 40% плодов с синдромом Дауна [10]. Между тем, пренатальная диагностика обоснована и целесообразна только тогда, когда риск рождения больного ребенка выше риска осложнений после применения манипуляций, предназначенных для получения плодового материала (биопсии хориона, амниоцентеза, кордоцентеза).

Инвазивные методы пренатальной диагностики – биопсия ворсинчатого хориона, амниоцентез, кордоцентез ассматриваются нами как селективные процедуры, позволяющие выйти на точный пренатальный диагноз. Указанные методы пренатальной диагностики следует применять при соответствующих показаниях только после УЗИ и под контролем УЗИ. Это позволит снизить число возможных осложнений и осуществить эти манипуляции в амбулаторных условиях. Инвазивные методы пренатальной диагностики практически не влияют на частоту самопроизвольных выкидышей, если четко придерживаться правил и не применять эти процедуры при наличии противопоказаний к их использованию.

По нашим данным беременность после применения инвазивных методов пренатальной диагностики завершилась самопроизвольным абортом в 5,3% случаев, а без применения инвазивных методов пренатальной диагностики в 5,2%. Статистических различий между группами не обнаружено.

Трансцервикальная биопсия хориона нами  проводилась на 7-12 неделях беременности, амниоцентез проводился на 15-20 неделях беременности, а кордоцентез не ранее 20-й недели беременности. Цитогенетические исследования проводятся в результате получения высококачественных хромосомных препаратов – фибробластов плода при использовании стандартного трининг-метода уже после 10-14 суточного культивирования их в плоскодонных флаконах в СО2-инкубаторе [5, 12].

С помощью «пипеточного» метода У.Клауссена, суть которого заключается в индивидуальном сборе миотических клеток микропипеткой, удается приготовить любое необходимое количество G-дифференциально окрашенных метафазных пластинок уже к концу первой недели культивирования [5].

Цитогенетическое исследование обычно проводится на культивируемых клетках с получением большого количества метафазных пластинок. При низком уровне митотического индекса анализируемого препарата постановка диагноза с использованием классических методов цитогенетического анализа сильно затруднена, а иногда и просто невозможна. Вот почему нами использовался молекулярноцитогенетический метод FISH (fluorescence in situ hybridization).

Преимуществом метода FISH является то, что не требуется большого количества биологического материала и возможно анализировать хромосомы на всех стадиях клеточного цикла, в том числе и в интерфазе. Указанные преимущества делают метод FISH особенно ценным в пренатальной диагностике: снижается риск осложнения беременности после проведения соответствующих инвазивных процедур и сокращается срок цитогенетической диагностики (2-3 дня вместо 2-3 недель при культивировании), что очень важно для решения вопроса сохранения беременности. Применение метода FISH делает возможным выявление сложных хромосомных аномалий (микроделеции, микротранслокации, инверсии, дупликации, низкие уровни хромосомного мозаицизма и др.).

За 2005-2007 годы нами проведено 6 биопсий хориона и 10 амниоцентезов. Показаниями для инвазивных методов пренатальной диагностики служили возраст старше 35 лет, синдром Дауна в анамнезе, низкие показатели АФП, сцепленные с полом заболевания (миопатия Дюшена, гемофилия, синдром РЛП-I), хромосомные перестройки у одного из родителей. Выявлено 2 случая синдрома Дауна.

Заключение

Таким образом, интенсивное развитие методов пренатальной диагностики, хромосомных болезней путем скринингового исследования крови беременных на протеин РАРР-А, ХГ и АФП, путем скринингового ультразвукового исследования и применения инвазивных методов пренатальной диагностики с использованием классических цитогенетических методов и метода FISH позволяет определить хромосомную патологию и обеспечивает прогресс традиционных направлений пренатальной диагностики. Это будет способствовать практическому внедрению принципиально новых подходов – определения кариотипа по клеткам плода, циркулирующим в кровотоке матери, преимплантационной диагностике, что очень важно в связи с развитием методов экстракорпорального оплодотворения.

Раннее выявление патологии у плода и возможное последующее прерывание беременности позволит многим женщинам, у которых риск рождения больного ребенка высок, решиться на повторную беременность.

Между тем актуальным для Армении являются  такие проблемы, как отсутствие программ по массовому скринингу маркерных эмбриональных белков в сыворотке крови беременных, слабая медико-генетическая подготовка врачей, неэффективное медико-генетическое консультирование, плохая информированность врачей и населения страны, прежде всего женщин, о реальных возможностях пренатальной диагностики. Преодоление отмеченных проблем, в значительной степени обусловленных недостаточным финансированием медицинской генетики и пренатальной диагностики, сыграет решающую роль в профилактике нe только хромосомных болезней, но и многих других наследственных и врожденных болезней.

Литература

1. Баранов В.Н.и др. // Биология. - 1989. - No. 2. -с.11-18.
2. Горин В.С., Серов В.Н., Шабин С.Г., Шин А.П., Горин Р.В. //»Акушерство и гинекология». - 2001. - No. 1.- с. 3-7.
3. Зурабян Н.П. Акушерские и клинико-генетические аспектыпрофилактики врожденных пороков развития // Автореф.дисс.... канд.мед.наук.- 1990. - 24с.
4. Кузнецова П.В., Баранов А.Н., Киселева Н.В. и др. // Вестник РоссийскойАссоциации акушеров-гинекологов. -1997. -3. - с. 95-99.
5. Линдина Л.И., Королева Т.А., Сорокина И.В. и др. Оптимизация пренатальной диагностики: медико-генетическое консультированиев профилактике наследственных болезней. - М.-1997. - с. 159-160.
6. Снайдерс Р.Дж., Николаидес К.Х. Ультразвуковые маркерыхромосомных дефектов плода. Перевод с английского Меджедева М.В., Михайлова А.В. -М. - 1997. - 214с.
7. Юдина Е.В. Ультразвуковая диагностика. - 1998. - No. 1- с. 11.
8. Brambati B.// Hum. Reprod. Update - 1993, 8, 11. - р. 1983-2000.
9. Casals E., Forfune A., Grudzinskas et al. // Prenatal Diagn.- 1996,vol.16, No. 5. - р. 1124-1129.
10. Christiansen M., Larsen S.O., Norgard Redersen W. // Lakartidiningen.- 1997, vol.94, No. 51-52. - р. 658-661
11. Haddow J.E., Palomaki G.E., Knight J. et al.// Engl.J. Med. -1998, vol. 338, No. 3. - р. 538-542.
12. Salonen R., Turpeinen I, Kurki L. et al. Material serum screeningfor Down's syndrome on population basis. Acta Obstet.Gynecol.Scand., - 1997. - 76. - p. 817- 821.

Вопросы, ответы, комментарии