Определение антимикробной активности препаратов, используемых в комплексном лечении больных пародонтитом

Определяли антимикробную активность препаратов Метрогил дента, Холисал и Солкосерил на сложной культуре микроорганизмов по разработанной методике. Выявлена степень выраженности антимикробного действия каждого ..
препарата.

Ключевые слова: антимикробная активность, Метрогил дента, Холисал, Солкосерил.

Актуальность проблемы  профилактики и лечения больных хроническим генерализованным пародонтитом обусловлена  не только значительным процентом распространения заболеваний пародонта  среди населения, но и, несомненно, недостаточным совершенством методов лечения данной  патологии.  Эффективность медикаментозного лечения недостаточна  вследствие низкой проникающей способности лекарственных агрегатов, что подтверждается  рецидивами и обострениями заболевания. Несовершенны методы  оценки  целенаправленной антимикробной  активности средств и препаратов. Что касается хирургических  методов,  то они тоже не всегда обеспечивают оптимальный эффект  [2—4, 8, 9].

Одним из путей повышения эффективности медикаментозного  лечения  является оптимальный выбор лекарственных препаратов. Однако на сегодняшний день методы определения антимикробной активности препаратов носят   во многом  субъективный характер вследствие  невозможности дифференцировать мертвые и живые микроорганизмы [1]. Избежать  этого можно,  применяя метод прямого  измерения интенсивности флюоресценции суспензий  клеток с препаратом  и без такового в корреляции со временем действия препарата.  В зависимости от принципа действия  препарата  (детергентного или  ингибирующего),  интенсивность флуоресценции должна возрастать или убывать во времени быстрее, чем без лекарственного   воздействия.  Это  и  будет  свидетельством   в пользу  антимикробной активности лекарственного препарата.

Целью работы было оценить  антимикробную активность препаратов Метрогил-дента, Холисал и Солкосерил на сложной культуре микроорганизмов. В задачи исследования  входило: выявить  активность  различных  препаратов  к  смешанной микрофлоре (микс  культуре  полости рта) с помощью  метода лазерной  флюоресценции. Провести сравнительную оценку антимикробной активности изучаемых препаратов  и антибиотиков.

Материал и методы

Метод лазерной  флюоресцентной диагностики основан на способности микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности флюоресцировать при облучении их лазером,  а также на варьируемости флюоресценции в зависимости  от особенностей микрофлоры и физикохимических  условий (например, при воздействии  на микрофлору  антибиотиков и антисептиков). Использовали новый экспресс-метод (ЛФД) для оценки  чувствительности микробов  к антибиотикам. Проведен  сравнительный анализ ЛФД с традиционными методами: оценена клиническая эффективность метода на сертифицированной медицинской аппаратуре.

Методика ЛФД исследования включала:

• асептический забор исследуемого  материала в стерильные  пробирки (смешанные культуры микроорганизмов);
• заполнение ими и исследуемыми препаратами планшеты  по стандарту (методом пограничных концентраций);
• маркировку планшет  и инкубацию  исследуемого объекта при температуре 37±2˚С;
• измерение интенсивности флюоресценции на сертифицированном аппарате Флюол для объектов с антимикробным препаратом (сразу, через 30 мин, через 1, 2 и, если необходимо, 24 ч), интерпретацию и сравнение результатов с исходными показателями контрольных образцов;
•  установку   планшеты   после   каждого   измерения снова в термостат;
• измерение для воспроизводимости результатов интенсивности флюоресценции контроля  (растворов  антимикробных  препаратов, материалов, в которых проводились исследования — пластик,  планшет);
• интерпретацию результатов.

Все измерения выполнялись на планшетном флюориментре   Флюол  с  возможностью  измерять   интенсивность флюоресценции во времени. Дополнительно образцы исследовали  на непланшетном сертифицированном аппарате ЛФД с использованием кюветного варианта геометрии измерений. Образцы  смешивали  разными  способами с антимикробными препаратами. Для инкубации использовали питательные среды и агар. Операции  с приготовлением образцов суспензий проводили  в стационаре для микробиологических материалов.  Точность  концентраций веществ в образцах обеспечивалась с помощью автоматических  микропипеток.

Микробиологическое исследование эффективности антимикробных препаратов  проводили  диско диффузионным и градиентным способами, которые заключались в определении ширины  области  размножения микроорганизмов на поверхности  питательной среды с нанесенным на ее поверхность препаратом  [1, 6, 7].

Численную  оценку  антимикробной активности каждого препарата  производили пользуясь  правилом  вычисления скорости  экспоненциального затухания. Данное правило  широко  известно  и используется  в экспериментальной аналитике [5]. Для этой цели определяли  временную точку на экспериментальном графике по отдельному образцу. В данной точке соотношение разности  интенсивностей  флюоресценции в максимуме для данного графика,  интенсивности флуоресценции в искомой  и в начальной точках составляло ≈ 0,37.

(Фmax—Фx)/(Фmax—Ф0) ≈ 0,37, (1)

где Фmax   — интенсивность флюоресценции в максимуме, Фx  — интенсивность флюоресценции в искомой  временной точке x, Ф0 — интенсивность флюоресценции в начале измерения. Затем необходимо определить число (в виде дроби), обратное найденному, это и будет числовым критерием эффективности антимикробного препарата.

Результаты и обсуждение

Проведено два независимых эксперимента по отслеживанию индуцированной лазером флуоресценции суспензий микроорганизмов с добавлением разных антимикробных препаратов во времени. Характерный ход кривых совпал по каждому препарату в ходе эксперимента (см. рисунок). Как видно, на представленной на рисунке кривой динамики интенсивности флюоресценции чистой культуры без препарата, в начале происходит монотонное увеличение количества активных флюорофоров, а затем его медленный рост. Это свидетельствует о том, что живые клетки проявляют жизненную активность, происходит выработка флюоресцирующих ферментов и размножение микробных клеток. Однако для суспензии клеток с препаратами Метрогил дента, Солкосерил, Линкомицин и Гентамицин мы наблюдали рост интенсивности флуоресценции в начале наблюдения, а потом ее постепенное замедление до состояния постоянства. Данный факт означает уменьшение жизнедеятельности микробных клеток со временем  до полной  ее остановки, и,  следовательно, дезактивацию микробных  клеток и их гибель.

Другая картина наблюдается для препарата Холисал: вначале — постепенное ускорение  интенсивности флюоресценции, затем ее замедление. Это можно объяснить детергентным  действием препарата, т.е. растворением внутриклеточных флюорофоров во внешней  среде при разрушении оболочек  детергентом,  вследствие  чего происходит  рост интенсивности флюоресценции вначале,  а затем ее остановка из-за дефицита уцелевших клеток. Сами препараты  интенсивность флюоресценции не меняют с течением  времени  и флюоресцируют слабо по сравнению с культурой клеток.

При эксперименте с препаратом  Солкосерил наблюдается замедление скорости изменения интенсивности флуоресценции до 0 на протяжении часа экспозиции и постепенное увеличение  в дальнейшем. Такая картина может подтверждать отсутствие антимикробного действия препарата, но первоначальная шоковая реакция микроорганизмов  все же была зарегистрирована. Механизмы подобного поведения клеток пока неизвестны.

По времени установления статического  равновесия исследуемого параметра можно определить величину антимикробной активности препаратов:  чем меньше время, тем выше антимикробная активность.  По результатам экспериментов, антимикробная активность  исследуемых препаратов  выстраивается в следующий ряд: Метрогил дента, Холисал. Солкосерил не является антимикробным препаратом, но может в некоторой степени подавлять активность клеток. Остальные два антимикробных препарата, взятых  в качестве  контроля  (Гентамицин, Линкомицин),  демонстрируют   несколько большую  антимикробную активность, чего и следовало ожидать.

Пример расчета эффективности антимикробного действия препарата (Гентамицин).

Определяют точку x на шкале времени, для которой выполняется условие (1). Максимальная интенсивность Фmax=2,6, а Ф0=1,4. Исходя из формулы (1), Фx=2,15. Затем находим по уровню 2,15 значение точки x: оно равно 0,4 ч. Определяем эффективность, беря обратную дробь от этой величины: ε =2,5 ч–1. Таким образом, можно привести количественные значения для препаратов в порядке убывания их эффективности: Гентамицин — 2,5 ч–1, Линкомицин — 2 ч–1, Метрогил дента —1,7 ч–1, Холисал —1,25 ч–1.

Изменение  интенсивности флюоресценции смешанной культуры микрофлоры полости рта под воздействием антимикробных препаратов.

Исходя из полученных показателей, антимикробным препаратом,  предпочтительным в терапевтических целях  в стоматологии, является Метрогил дента.

Были  проведены  также микробиологические оценки наличия  антимикробного действия  препаратов. У всех препаратов, кроме Солкосерил зафиксировано подавляющее действие на рост микрофлоры.

Активность препаратов  для использования в пародонтологии  можно оценивать в процентах относительно активности Гентамицин. Она составит 68% для препарата Метрогил дента и 50% — для Холисал.

Таким образом, изученные препараты оказывают антимикробное действие на смешанную  культуру клеток, встречающихся у больных пародонтитом. Антимикробное действие препаратов убывает в следующем порядке (с указанием численного  критерия): Гентамицин — 2,5; Линкомицин — 2; Метрогил дента —1,7; Холисал —1,25. Солкосерил не оказывает  антимикробного действия,  но может частично  подавлять  жизнедеятельность микрофлоры. Объяснение этому факту пока не найдено.
 

ЛИТЕРАТУРА

1. Александров М.Т. Лазерная клиническая биофотометрия. М 2008;267—296.
2. Грудянов А.И., Калинин В.И., Орехова Л.Ю. и др. Организация пародонтологической помощи  в стоматологических учреждениях. В сб: Съезд   стоматологической  ассоциации   России,    6-й:   Труды.   М2000;194—197.
3. Грудянов  А.И.,  Овчинникова В.В. Лечение  воспалительных заболеваний пародонта  препаратом  Метрогил дента.  В сб.: Новые медицинские технологии. Международная ассамблея,  3-я. М 2001;130—131.
4. Грудянов  А.И., Овчинникова  В.В., Дмитриева  Н.А.    Антимикробная противовоспалительная   терапия    в   пародонтологии.   М:    МИА2004;80.

Вопросы, ответы, комментарии