Влияние лигандов Toll-like, NOD-like рецепторов и IL-4 на продукцию IL-10 и IL-1Я моноцитами периферической крови человека (Экспериментальная и профилактическая медицина)

Ключевые слова: моноциты периферической крови человека, Toll-like рецепторы (TLR1, TLR2), NOD-like рецепторы (NOD1, NOD2), IL-10, IL-1Я, MDP (мурамил-дипептид), PGN (пептидогликан из E.coli), Pam3CSK4 (синтетический бактериальный липопротеин)

Под понятием “иммунитет” часто понимают защиту организма от инфекции. Однако в более широком биологическом смысле – это реакция организма на все биологическое “чужеродное”, которое попадает в организм из внешней среды или возникает в самом организме вследствие мутационного процесса, постоянно протекающего в соматических клетках. Поэтому считается, что генеральная функция иммунной системы – поддержание морфофункциональной целостности организма. Защита от инфекций осуществляется с помощью двух систем – неспецифического (врожденного) и специфического (приобретенного) иммунитета. Неспецифический иммунитет выступает как первая линия защиты, а система приобретенного иммунитета выполняет функции специфического распознавания “чужеродного”, формирования иммунологической памяти и регуляции индукции врожденного иммунитета. Система врожденного иммунитета действует на основе воспаления и фагоцитоза. Сложная система приобретенного иммунитета основана на специфических функциях лимфоцитов, распознающих чужеродные макромолекулы и реагирующих на них либо непосредственно, либо выработкой защитных специфических белковых молекул – антител [1,2].  

Пептидогликан – важнейший компонент  клеточной стенки бактерий, выполняющий механические функции осмотической защиты клетки и обладающий антигенными свойствами [5]. MDP представляет собой активный фрагмент бактериальных клеточных стенок, ответственный за иммуностимулирующий эффект целых бактерий. Доказано, что MDP является природным регулятором иммунитета, выработанным в процессе эволюции. Клетками-мишенями для действия MDP в организме являются моноциты/макрофаги. В этих клетках MDP усиливает фагоцитоз, противовирусный эффект, синтез некоторых цитокинов [4,9]. Таким образом, MDP стимулирует фагоцитоз, клеточный и гуморальный иммунитет.

 Моноциты обладают выраженной фагоцитарной функцией. Это самые крупные клетки периферической крови. Они могут поглощать относительно крупные частицы и клетки и, как правило, не погибают после фагоцитоза. Этим они отличаются от нейтрофилов и эозинофилов, способных поглощать лишь относительно небольшие частицы и, как правило, погибающих после фагоцитоза. Моноциты способны фагоцитировать микробы в кислой среде, в то время как нейтрофилы неактивны [1,2,7].

В развитии межклеточного взаимодействия на фоне антигенной стимуляции важно отметить роль цитокинов, таких как IL-10 и IL-1в, которые  регулируют межклеточные и межсистемные взаимодействия, определяют выживаемость клеток, стимуляцию или подавление их роста, дифференцировку, функциональную активность и апоптоз, а также обеспечивают согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем как в нормальных условиях, так и при воздействии патологических факторов [2,3,6,8]. 

Целью настоящей работы явилось изучение влияния PGN, MDP, Pam3CSK4 и IL-4  на продукцию IL-10 и IL-1Я моноцитами периферической крови человека.

Материал и методы

Была использована гепаринизированная периферическая кровь здоровых доноров возрастной группы от 29 до 43 лет. Мононуклеары (моноциты) периферической крови здоровых доноров выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности histopaque (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), при 1500 об/мин в течение 45 мин  при 25⁰C. Мононуклеары промывали 2 раза PBS (фосфатно-буферный раствор) и добавляли 1 мл питательной среды RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2mM L-глютамина, 1mM пирувата натрия, 100U/ml пенициллина  и 100 µg/ml стрептомицина. Затем пробирки инкубировали в термостате при 37⁰C в течение 1.5 часа. После окончания инкубации удаляли не адгезирующие на пластик лимфоциты, а к клеткам добавляли либо по 2.5 µg/ml PGN, либо по 2.5 µg/ml Pam3CSK4, либо по 5 µg/ml MDP, а в качестве контроля добавляли питательную среду и инкубировали в течение 3 дней. Собирали супернатанты и хранили в холодильнике при температуре -80⁰C. Пробирки с клетками отмывали PBS, рестимулировали антивоспалительными молекулами IL-4 и в качестве контроля добавляли питательную среду и инкубировали в термостате при 37⁰C в течение 3 дней, после чего снова собирали супернатанты и хранили в холодильнике при температуре -80⁰C.

Концентрацию IL-1Я и IL-10 исследовали методом иммуноферментного анализа, используя тест SET-Go (eBioscience).

Данные статистически обрабатывали методом компьютерной программы GraphPad, с использованием параметрических и непараметрических методов.

Результаты и обсуждение 

Как показали результаты проведенных исследований (рис.1), стимуляция NOD1 и NOD2 рецепторов с помощью PGN статистически достоверно повысила продукцию IL-10 по сравнению с Pam3CSK4-стимулированными и  нестимулированными моноцитами. NOD2 лиганд MDP значительно индуцирует продукцию IL-10, тогда как стимуляция TLR2-TLR1 рецепторов – лигандом Pam3CSK4 приводит к снижению продукции синтеза IL-10. 

Рис.1. Продукция IL-10 нестимулированными, PGN-, MDP- и Pam3CSK4- стимулированными моноцитами человека

Синтез IL-1β PGN-, Pam3CSK4- или MDP-стимулированными моноцитами значительно не отличается от синтеза IL-10, причем, лиганд NOD2 рецептора MDP индуцировал низкий уровень синтеза IL-1b культивируемыми моноцитами (рис.2).

Рис.2. Продукция IL-1β нестимулированными, PGN-, MDP- и Pam3CSK4- стимулированными моноцитами

Как видно из приведенных данных, стимуляция NOD1 и NOD2 рецепторов с помощью PGN статистически достоверно повышает синтез как IL-10, так и продукцию IL-1β, в то время как стимуляция TLR2-TLR1 рецепторов Pam3CSK4 и NOD2 рецептора MDP  приводит к снижению продукции синтеза IL-10 и IL-1β.

С целью исследования пластичности синтеза цитокинов лигандами моноциты, стимулированные PGN, Pam3CSK4 и MDP, рестимулировали рекомбинантным IL-4 в течение 3 дней. Результаты проведенных исследований показали, что моноциты, первоначально стимулированные PGN, а в дальнейшем проинкубированные с IL-4, не продуцируют одинаковый уровень IL-1β. Такой же результат мы получили, исследуя синтез IL-1β первоначально стимулированными  Pam3CSK4, а затем  проинкубированными с IL-4 моноцитами (рис.3). 

Рис.3. Синтез IL-1β рестимулированными IL-4 моноцитами 

Необходимо отметить, что первоначально уровень IL-10 повысился лишь в условиях инкубации нестимулированных клеток с IL-4 (рис.4).

Рис.4. Синтез IL-10 рестимулированными IL-4 моноцитами

Таким образом, сравнительное изучение действия разных агонистов на синтез IL-10 и IL-1Я показало, что стимуляция NOD1 и NOD2 рецепторов с помощью PGN повышает синтез как IL-10, так и  IL-1Я по сравнению с другими агонистами. Результаты показали также, что продукция IL-10  нестимулированными, а в дальнейшем IL-4 стимулированными моноцитами повышается.

Поступила 17.01.11

Литература

1. Абелев Г.И.  Основы иммунитета, М., 1996.
2. Галактионов В.Г. Иммунология, М., 1998.
3. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции воспаления и иммунитета. Иммунология, 1995, 3, с.30-44.
4. Степанова Е.Н., Кашкин К.П., Китаева М.Н., Абашев Ю.П. Иммунология, 1985, 3, с. 37-40.   
5. Франклин T., Сноу Дж. Биохимия антимикробного действия, пер с англ. M., 1984.
6. David Male, Roitt I, et al. Immunology (7th ed.). London: Mosby, 2006.
7. Jeneway Ch.A., Travers P.  Immunology, 1994.
8. Roitt’s Essential Immunology, 11th Edition, Wiley-Blackwell, 2006.
9. Vongthip Souvannavong, Spencer Brown and Arlette Adam, Service de Cytomйtrie, CNRS, 91198 Gif-sur-Yvette, France, Institut de Biochimie, Universitй Paris-Sud, Bвt.432, 91405 Orsay, France, 1995.

А.Г.Сукиасян, Т.К.Давтян, Ю.Т.Алексанян Научно-исследовательский институт эпидемиологии, вирусологии и медицинской  паразитологии им. А.Б.Алексаняна 0060, Ереван, ул. Худякова, 1  Исследовательский центр “Арменикум” 0084, Ереван, ул. Шерами, 2 УДК 612.017.1

Вопросы, ответы, комментарии