Уровень и активность анти- и прооксидантных металлопротеинов после скэнар-стимуляции у крыс

Ключевые слова: СКЭНАР-стимуляция, антиоксидантные, прооксидантные металлопротеины, уровень, активность 

В условиях электрической стимуляции (ЭС) у млекопитающих отмечается повышение активности антиоксидантных защитных систем организма [16]. 

Установлено, что в результате высокочастотной (100 Гц) ЭС супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса у крыс отмечается повышение уровня и активности NADPH-зависимых О2–- продуцирующих и метHb-восстанавливающих изоформ цитохрома b558  клеточных мембран, митохондрий и ядер тканей селезенки, мозга, сердца, почек и печени крыс. Выдвинуто предположение о возможном стимулировании иммунной системы (ключевым компонентом которой является NADPH оксидаза) и кислородного гомеостаза регулированием генома и энергетического баланса в дыхательной цепи митохондрий [6]. 

С другой стороны, показано, что биологический эффект импульсных воздействий (токов низкой и средней частоты, электрических и магнитных полей) включает самые разнообразные феномены, связанные с влиянием воздействующего фактора на морфологическое и функциональное состояние тканей и обмен веществ. Для терапевтического неинвазивного воздействия на кожные покровы человека с целью оказания регулирующего влияния на физиологические системы успешно используется прибор СКЭНАР – самоконтролируемый энергонейроадаптивный регулятор [11]. 

Актуальность исследования эффектов СКЭНАР-стимуляции определяется выявившимся в ходе лечебной практики необычайно широким диапазоном его оздоровительного действия. Предполагается, что СКЭНАР приводит в действие некоторую общую систему организма, ответственную за его самовосстановление – систему внутреннего доктора. Действие внутреннего доктора связано с процессами синхронизации медленноволновой электрической активности в структурах головного мозга (кора и передний отдел гипоталамуса) и переходом работы висцерального мозга из режима мобилизации ресурсов, обеспечиваемого активацией симпатической автономной нервной системы – системы бодрствования, в режим восстановления ресурсов при ведущей роли парасимпатической автономной системы [9]. Можно заключить, что синхронизированная медленноволновая активность представляет собой основной электрофизиологический коррелят эффективного действия  СКЭНАР. 

В ответ на раздражения кожи аппаратом СКЭНАР в коре мозга и в гипоталамусе обнаруживались низкоамплитудные вызванные потенциалы с пиком латенции в пределах 70 -100 мс. Эти потенциалы, возможно, отражают приход возбуждения по медленнопроводящим волокнам спинно-таламического тракта, отдающего ответвление и к гипоталамусу. Известно, что в коре этот тракт в основном оканчивается во вторичной соматосенсорной зоне и действие СКЭНАР можно во многом связать с активностью именно таких волокон [5]. 

Микроэлектрофизиологические исследования активности нейронов ЦНС в отделах мозга, связанных с рядом аминокислотных и пептидных нейромедиаторов (в частности в аркуатном, паравентрикулярном и супраоптическом ядрах гипоталамуса) в условиях воздействия на подошву задней конечности крыс аппаратом СКЭНАР, свидетельствуют о том, что к СКЭНАР-стимуляции чувствительны нейроны с гетеронейромедиаторными системами [3]. 

СКЭНАР-терапия оказывает положительное действие при лечении  диабетической ретинопатии, атрофии зрительного нерва и нейросенсорной тугоухости [1, 2]. Эффективность СКЭНАР-терапии, по самым разным и независимым источникам, составляет в среднем более 80% [10]. Успешное использование СКЭНАР-терапии требует объяснения механизмов ее эффективности. 

Известно, что за счет высокоамплитудного воздействия СКЭНАР-стимуляции возникает дополнительный или существенно усиленный эффект вибрации на цитоплазму подлежащих тканей, что стимулирует, в частности, транспорт продуктов клеточного обмена, нейротрансмиттеров, нейромодуляторов [10]. Подобное воздействие вызывает в организме сложные многофункциональные изменения. 

Экспериментальные факты свидетельствуют, что в качестве центрального механизма эффекта СКЭНАР-стимуляции выступает синхронизация работы коры мозга и гипоталамуса [11]. В исследованиях Л.X. Гаркави с сотр. отмечается сохранение этих эффектов в последействии (проявляется в виде роста альфа-подобных колебаний в коре мозга), что служит коррелятом антистрессорной реакции тренировки, с ее важными оздоровительными последствиями [4].

Известно также, что через 1 ч после ЭС изолированных мышц подошвы крыс наблюдается повышение активности (63%) и экспрессия гена (80%) цитрат синтазы. При этом повышаются активности Mn-СОД,  Cu,Zn-СОД, каталазы (44%) и глютатионпероксидазы (ГПО). Этот эффект предлагается для повышения каталазной активности в скелетных мышцах при тренировках, когда из-за снижения каталазной активности происходит оксидативное повреждение этих мышц [16]. 

В результате ЭС кожи крыс на фоне увеличения активности СОД в плазме крови происходит снижение уровня молочной кислоты, а также малонового диальдегида (МДА) – продукта липидной пероксидации [15]. Под влиянием острого и хронического электрошока в мембранах клеток гиппокампа крыс наблюдается повышение активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, снижение уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ). Таким действием электрошок оказывает антистрессорный эффект на гиппокамп крыс [12]. При электросудорожном припадке крыс в гиппокампе, мозжечке и фронтальной коре головного мозга наблюдается повышение активности СОД и ГПО, хотя уровень ПОЛ практически не изменяется [18]. В свою очередь, ЭС (1-4 Гц) вызывает повышение уровня О2–, продуцируемых NADPH оксидазой, увеличивается частота импульсов сердечной ткани крыс [14]. 

K настоящему времени молекулярно-биохимические механизмы воздействия СКЭНАР-терапии не изучены. Целью данного исследования является анализ эффективности стимуляции аппаратом СКЭНАР в аспекте регуляции ключевых металлопротеинов антиоксидантной активности (МАА) и металлопротеинов  прооксидантной активности (МПА) в клеточных образованиях тканей селезенки, костного мозга и крови крыс. 

Материал и методы

У белых половозрелых крыс-самцов массой 220-250 г под нембуталовым наркозом (40 мкг/кг) осуществляли СКЭНАР-стимуляцию (уровень тока 90, интенсивность 3, Z 30) в следующем режиме: по 1 минуте на задние лапы (общерегуляторные зоны) и в течение 30 сек на ушную раковину (Диаз-1 с первичной реакцией 205). Эффективность СКЭНАР-терапии объясняется следующими основными причинами: высокоамплитудным, неповреждающим коротким воздействием; существенной вариабельностью сигнала – СКЭНАР генерирует сигнал в виде импульсов с частотой следования от 15 до 350 Гц, имеет возможность установки качающейся частоты (30-120 Гц); наличием биологической обратной связи, где каждый последующий импульс отличается от предыдущего; методическими особенностями перемещения аппарата при воздействии. Это позволяет воздействовать на кожные покровы таким информационным потоком, к которому не возникает адаптация [10].

Через 1-1,5 ч после СКЭНАР-стимуляции животных (n=8) декапитировали и кровь, собранную порциями по 5 мл, стабилизировали 0,2% оксалатом натрия. Ткани селезенки и костного мозга брали порциями по 0,1 г. В качестве контроля использовали показатели интактных крыс (n=8).

МАА (Mn-СОД, Cu,Zn-СОД, каталаза) и МПА (супероксид-продуцирующий липопротеин сыворотки – супрол, фракции изоформ цитохрома (цит) b₅₅₈ кислого характера из сыворотки крови, эритроцитарных мембран (ЭМ), а также мембран, ядер и митохондрий клеток селезенки и костного мозга) получали лицензированными способами с использованием ионообменной хроматографии на целлюлозах DE-52 и KM-52 [7, 8]. 

1. Выделение фракции супрола из сыворотки крови и фракции изоформ цитохрома b₅₅₈ из сыворотки и ЭМ, а также Cu,Zn-COД и каталазы из цитоплазмы эритроцитов

После самоосаждения эритроцитов и центрифугирования в течение 5 мин при 5000 об/мин, надосадочный раствор (сыворотку) центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин для удаления клеток плазмы и следов эритроцитов. Сыворотку ставили на диализ против воды после осаждения супрола под влиянием Fe⁺³ [11]. Далее супернатант ставили на диализ против воды. После ионообменной хроматографии диализата на сефадексе DEAE A-50 фракцию экстрацеллюлярного цит b₅₅₈ сыворотки элюировали 0,04 М калий-фосфатным буфером  рН 7,4 (КФБ).

После промывания эритроцитов 0,9% NaCl гемолиз эритроцитов осуществляли водой (1:5 об/об). Далее, после центрифугирования гемолизата при 12000 об/мин, в надосадочном растворе определяли активности Cu,Zn-СОД и каталазы. Из осажденных ЭМ солюбилизировали фракцию изоформ цит b558  кислого характера [12]. После диализа и центрифугирования надосадочный раствор подвергали ионообменной хроматографии на колонке с целлюлозой КМ-52 (уравновешенной 0,002 М КФБ) для удаления следов гемоглобина. Не задержавшуюся на этой колонке фракцию осаждали на колонке с целлюлозой DE-52 (уравновешенной также 0,002 М КФБ). Из этой колонки фракцию цит b₅₅₈ кислого характера элюировали 0,4 М КФБ.

2. Выделение фракции Cu,Zn-COД, Mn-СОД и каталазы из цитоплазмы клеток селезенки и костного мозга, а также фракции цитохрома b₅₅₈ из мембран, митохондрий и ядер клеток селезенки и костного мозга

Процедуру получения этих белков осуществляли лицензированными  способами [7, 8]. В частности, после гомогенизации тканей в 0,25 М сахарозе, ядра осаждали путем центрифугирования гомогената при 3000 об/мин в течение 10 мин, митохондрии – при 10000 об/мин в течение 10 мин, а мембраны клеток – при 6000 об/мин при рН 5,6 в течение 20 мин. Осажденные ядра, мембраны и митохондрии промывали водой и повторно центрифугировали (для удаления следов ионов солей и сахарозы). Из осажденных субклеточных формирований фракцию цит b₅₅₈ кислого характера солюбилизировали и после диализа против воды и центрифугирования надосадочный раствор обрабатывали аналогичным для получения цит b₅₅₈ из ЭМ способом [11].

Таким образом, фракции МАА и МПА выделяли из восьми проб эритроцитов, селезенки и костного мозга опытных и контрольных групп. 

СОД активность фракций, NADPH-зависимую О₂¯-продуцирующую активность фракций изоформ цит b₅₅₈, а также О₂¯-продуцирующую активность супрола определяли нитротетразолиевым синим (НТС) методом [8], путем определения процента снижения (при определении СОД активности) или увеличения (при определении О₂¯-продуцирующей активности) плотности максимального оптического поглощения формазана (при 560 нм), который образуется в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу СОД активности принимали количество фракции, которое вызывает 50% снижение (для СОД) или 50% увеличение (для О₂¯-продуцирующей активности белка) плотности поглощения формазана. Удельные активности были определены в расчете на 1 мл эритроцитов, 1 г ткани или 1 мл фракции. 

Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим титрованием раствора Н₂О₂ в присутствии или отсутствии определенного количества каталазы. За единицу каталазной активности принимали количество фракции, расщепляющей 0.1 М Н₂О₂ в течение 1 мин при 20^o. ФерриHb-восстанавливающую активность фракций изоформ цит b₅₅₈ кислого характера определяли следующим образом. К 3 мл раствора ферриHb из цитозоля эритроцитов добавляли 0,2 мл цит b₅₅₈ (плотность оптического поглощения матричного раствора А₅₃₀=0,3) и после инкубации при 36^oС в течение 5-6 ч определяли кинетику снижения б-полосы поглощения ферриHb (при 565 нм), которая прямо пропорциональна увеличению поглощения ферроHb (при 555 нм). За единицу ферриHb-восстанавливающей активности принимается то количество цит b₅₅₈, которое снижает плотность альфа-поглощения ферриHb на 50%. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера, с определением критерия достоверности (Р).

Результаты и обсуждение 

Согласно данным настоящего исследования, через 1-1,5 ч после воздействия СКЭНАР начинается постепенный выход крыс из состояния сонливости.

Таблица 1

Изменения уровня (А₅₃₀ нм), NADPH-зависимой О₂^–-продуцирующей и ферриHb-восстанавливающей активности изоформ цит b₅₅₈ из тканей и субклеточных образований белых интактных крыс (К) и крыс после их электрической стимуляции (ОП), P‹0.05, n=8

На этом этапе уровень и активность МАА и МПА претерпевают неоднозначные изменения (табл. 1). На фоне повышения уровня экстрацеллюлярного цит b₅₅₈, фракции изоформ цит b₅₅₈ ядер клеток селезенки, а также уровня супероксидпродуцирующего липопротеина сыворотки (супрол) наблюдается снижение уровня фракции изоформ цит b₅₅₈ из ЭМ, мембран и митохондрий клеток селезенки. При СКЭНАР-стимуляции наблюдается резкое повышение (до 4,5 раз) уровня фракции изоформ цит b₅₅₈ из клеток костного мозга.  С другой стороны, повышение уровня, а также NADPH-зависимой О2–-продуцирующей активности фракции изоформ цит b₅₅₈ в стволовых клетках костного мозга свидетельствует о стимулирующем действии этих клеток (последние являются факторами модуляции иммунной системы и восстановления поврежденных тканей путем стимулирования пролиферации клеток). Однако СКЭНАР-стимуляция вызывает снижение уровня цит b₅₅₈ из ЭМ, мембран клеток селезенки (МКС) и, особенно, митохондрий клеток селезенки. В последнем случае наблюдается агрегация цит b₅₅₈. Снижение уровня фракции изоформ цит b₅₅₈ из ЭМ, возможно, связано с повышением стабильности ЭМ и МКС, что может снизить процесс солюбилизации цит b558 из ЭМ и МКС. Фактически, СКЭНАР-стимуляция в приведенном режиме отрицательно влияет только на митохондрии клеток селезенки, снижая уровень и NADPH-зависимую О_2¯ -продуцирующую активность изоформ цит b₅₅₈ в этих субклеточных формированиях. Видимо, и этот эффект оставляет свой отпечаток в процессе сонливости крыс под влиянием СКЭНАР-стимуляции, путем снижения интенсивности окислительно-восстановительных энергообразующих процессов с участием О2– в дыхательной цепи митохондрий [17]. С другой стороны, снижение уровня солюбилизированного цит b₅₅₈ из МКС компенсируется повышением NADPH-зависимой О₂¯-продуцирующей активности цит b558 (табл. 2). 

Таблица 2

Изменения  СОД и каталазной активности клеток тканей интактных крыс (К) и крыс после СКЭНАР-стимуляции (ОП), P‹0.05, n=8

Временная потеря подвижности  в результате СКЭНАР-стимуляции, видимо, связана с ослаблением интенсивности дыхания, из-за снижения ферриHb-восстановительной активности изоформ цит b₅₅₈ из приведенных тканей и крови.

В клетках костного мозга и селезенки наблюдается изменение уровня и активности МПА, которое происходит на фоне резкого увеличения Cu,Zn-СОД и каталазной активности цитозоля эритроцитов, а также некоторого повышения суммарной активности Cu,Zn-СОД и Mn-СОД. Значительное повышение СОД и каталазной активности в клетках тканей крыс под влиянием ЭС является аутоиммунным ответом адаптационных систем этих тканей против повышенного уровня О₂^–, ферментативная дисмутация которых приводит к накоплению Н₂О₂ [13] (вследствие чего повышается активность каталазы).

Действие СКЭНАР-стимуляции на уровень и активность МАА и МПА у интактных крыс приводит к характерному повышению прооксидантного статуса. Возможно, при различных патологических состояниях, действуя этим механизмом, ЭС аппаратом СКЭНАР, повышая уровень и активность МАА и МПА, может стимулировать аэробные метаболические процессы клеток органов иммунной системы (костный мозг, селезенка, а также эритроциты) с участием активных форм кислорода и вызывает терапевтический эффект.

Таким образом, СКЭНАР-стимуляция приводит к неадекватным изменениям  уровня, NADPH-зависимой O₂^–-продуцирующей и ферриHb-восстанавливающей активности фракции изоформ цит b₅₅₈ из эритроцитарных мембран, сыворотки крови, субклеточных компонентов селезенки и клеток костного мозга. При этом в большинстве случаев отмечается  повышение NADPH-зависимой O_2¯ продуцирующей активности и снижение ферриHb-восстанавливающей активности изоформ цит b₅₅₈ с увеличением каталазной и СОД-активностей клеток органов иммунной системы. 

Из приведенных данных особое значение имеет увеличение уровня (до 4.5 раз)  и 64% увеличение NADPH-зависимой O_2¯-продуцирующей активности фракции изоформ цит b₅₅₈ из стволовых клеток костного мозга, как ключевого фактора восстановления поврежденных тканей со стимулированием их пролиферации.

Поступила 19.07.10

Литература

1. Арутюнян Р.Р., Испирян К.Г. Комплексный подход при лечении диабетической ретинопатии . Научно-медицинский журнал им. Авдалбекяна, 2008, 2, с. 3-8. 
2. Арутюнян Р.Р. Комплексное аппаратное лечение нейросекреторной тугоухости. Изв. научно-технической Национальной академии РА, 2009, 2, с. 71-78. 
3. Арутюнян Р.Р., Чавушян В.А., Степанян А.Ю., Саркисян Дж.С. Электрофизиологическое исследование в различных нейромедиаторных структурах мозга эффектов стимуляции акупунктурных зон аппаратом СКЭНАР. Вестник МАНЭБ Санкт-Петербурга, 2009, 14(4), с. 134-144. 
4. Гаркави Л. X. и др. Антистрессорные реакции и активационная терапия. М.: ИМЕДИС, 1998. 
5. Гринберг Я. З. Эффективность СКЭНАР-терапии. Физиологические аспекты. В сб.: СКЭНАР-терапия, СКЭНАР-экспертиза. Таганрог, 1998, вып. 4, с. 8. 
6. Mелконян Л.Г., Симонян Р.М., Симонян Г.М. , Бабаян М.А.,  Аракелян Л.Н., Aйрапетян Р.Л., Симонян М.А. и Галоян А.А. Повышение уровня NADPH-зависимой O2–-продуцирующей и ферригемоглобин-восстанавливающей активностей изоформ цитохром b558 из мембран, митохондрий и ядер клеток органов крыс после электрической стимуляции супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса.  Нейрохимия, 2010, 27(2), с. 1-4. 
7. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А.  Способ получения цитохромов b558 из клеточных компонентов. Лицензия изобретения Армпатента N А-2233, Ереван, 2008.
8. Симонян М.А., Симонян Р.М., Симонян Г.М.  Способ получения металлопротеинов крови. Лицензия изобретения Армпатента N 341, Ереван, 1997.
9. Сунцова Н. В. Переднемозговые механизмы развития сна. Дис. … д. б. н. РГУ, Ростов н/Д, 2000. 
10. Тараканов А.В. Начальные и конечные точки энергетических меридианов. Диагностика и принципы лечения СКЭНАР-ом, Ростов н/Д, 2008, 87с. 
11. Чебкасов С. А. Стратегия здоровья. Система опережающего самовосстановления биоструктур. Проблема активации парасимпатической вегетативной системы. Валеология, 2000, 1, с. 80. 
12. Barichello T., Bonatto F., Feier G. et al. No evidence for oxidative damage of hippocampus after acute and chronic electroshock in rats. Brain Res., 2004, 1014(1-2), p. 177-183. 
13. Fridowich I. Superoxide radical and SOD. Annu.Rev.Biochem., 1995, 64, p. 97-112. 
14. Heinzel F.R., Luo Y., Dodoni G et al.  Formation of reactive oxygen species at increases contraction frequency in rat cardiomyocites. Cardiovasc.Res., 2006, 71(2), p. 374-382. 
15. Liang Y., Fang J.G., Wang C.X., Ma C.Z.  Effects  of transcutaneuos electric acupoint stimulation on plasma SOD an MDA in rats with sports fatigue. Zhen Chi Yanjiu, 2008, 33(2), p. 120-123. 
16. Pimenta Ada S., Lambertucci R.H., CorjaoR., Silveira L.R., Curi R. Effect of simple session of electrical stimulation on activity and expression of citrate synthase and antioxidant enzymes in rat soleus muscle. Eur.J. Appl. Physiol., 2007, 102(1), p. 119-126. 
17. Tailla C., El-Benna J., et al  Mitochondrial respiratory chain and NADPH oxidase are targets for the antiproliferative effects of carbon monoxide in human airway smooth muscle. J.Biol.Chem., 2005, 200(27), p. 25350-25360. 
18. Zupan G., Pilipovii K., Hrelja A., Peternel S.  Oxidative stress parameters in different brain structures after electroconvulsive shock-induced seizures. Prog. Neuropharmacol. Mol.Biol.Phsychiatry, 2008, 32(3), p. 771-777. 

Л.Г. Мелконян¹, Р.М.  Симонян², В.А. Чавушян⁴,  Г.М. Симонян², Р.Р. Арутюнян3, М.А. Бабаян²,  М.А. Симонян^{2 1}Государственный педагогический институт  им. М.Налбандяна, Гюмри ²Институт биохимии НАН РА им. Г.Х.Бунятяна ³Восстановительный центр здоровья «Р. и П. СКЭНАР» ⁴Институт физиологии НАН РА им. Л.А.Орбели 0014, Ереван, ул. П. Севака, 5/1 УДК 577.613

Вопросы, ответы, комментарии