Влияние Lactobacillus acidophilus на индукцию эндотоксиновой толерантности культивируемых моноцитов человека

Ключевые слова: Lactobacillus acidophilus, LPS, IL-10, IL-1ß, моноциты периферической крови человека

Иммунная система не только распознает патогены и отвечает индукцией провоспалительных медиаторов, но способна также подавлять воспаление, которое может вызывать тканевую деструкцию [3]. Показательный пример этого – эндотоксиновая толерантность, которая характеризуется пониженной способностью клеток-мишеней (моноциты, макрофаги) отвечать на активацию повторной дозой липополисахарида (LPS) после первичной экспозиции клеток с этим стимулятором. Эндотоксиновая толерантность выражается в способности клеток продуцировать антивоспалительные цитокины [6]. Моноциты обладают выраженной фагоцитарной функцией. Это самые крупные клетки периферической крови. Они могут поглощать относительно крупные частицы и клетки и, как правило, не погибают после фагоцитоза. Этим они отличаются от нейтрофилов и эозинофилов, способных поглощать лишь относительно небольшие частицы и, как правило, погибающих после фагоцитоза. Моноциты способны фагоцитировать микробы в кислой среде, когда нейтрофилы неактивны [1,2,4]. 

Проблема стимуляции иммунного ответа является важнейшей в иммунологии. В имеющейся литературе мы встретили лишь единичные данные, касающиеся иммуностимулирующей активности Lactobacillus acidophilus, и, поэтому, представляет значительный интерес его дальнейшее углубленное изучение с выяснением различных параметров иммунологической активности [5,7,8].

Целью настоящей работы явилось изучение влияния Lactobacillus acidophilus на индукцию эндотоксиновой толерантности культивируемых моноцитов человека путем определения продукции IL-1ß и IL-10 эндотоксин-стимулированными моноцитами.

Материал и методы

Для культивации бактерий Lactobacillus acidophilus использовали Lactobac агар. После посева переносили чашки Петри в термостат при 37⁰C на 4 суток. Собирали бактерии, добавляя в чашки фосфатно-буферный раствор (PBS), разводили и переливали в стерильную пробирку. Центрифугировали при 3000 об/мин 7 минут, промывали 2 раза. Определяли мутность специальным устройством с оптической плотностью 600 нм (1.5), что соответствует 5x10⁸ клеток в 6 ml. Для культивирования Lactobacillus acidophilus применяли питательную среду RPMI-1640, содержащую 10% эмбриональную телячью сыворотку (FCS), 2mM L-глютамина, 1mM пирувата натрия, 100U/ml пенициллина и 100 µg/ml стрептомицина. При проведении эксперимента использовали 5 пробирок, одна из которых контрольная, куда добавляли лишь моноциты и питательную среду. В остальные 4 пробирки, кроме моноцитов и среды, добавляли также разные концентрации бактерий (3.125x10³; 6.25x10³; 12.5x10³; 25x10³). Пробирки переносили в термостат при 37⁰C на ночь. На следующий день собирали супернатанты и хранили в холодильнике при температуре -80⁰C.

Была использована гепаринизированная периферическая кровь здоровых доноров возрастной группы от 29 до 43 лет. Мононуклеары (моноциты) периферической крови здоровых доноров выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности (histopaque), содержащей 6% CO₂ (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), при 1500 об/мин в течение 45 мин при 25⁰C. Мононуклеары промывали 2 раза PBS и добавляли 1 мл описанной выше питательной среды. Затем инкубировали в термостате при 37⁰C в течение 50 минут. После окончания инкубации удаляли не адгезирующие на пластик лимфоциты, а к клеткам добавляли либо LPS, либо Lactobacillus acidophilus и инкубировали 18 часов при 37⁰C. Собирали супернатанты и хранили в холодильнике при температуре -800C. Пробирки отмывали PBS и добавляли питательную среду или LPS и инкубировали в термостате при 37⁰C 5 часов, после чего снова собирали супернатанты и хранили в холодильнике при температуре -80⁰C.

Эндотоксиновую толерантность исследовали, измеряя продукцию IL-1ß стимулированными LPS моноцитами в присутствии или отсутствии 2 доз LPS. Моноциты, которые были промыты 3 раза эндотоксин-несодержащим PBS, в количестве 5x10⁵ кл/мл культивировали в питательной среде в течение 18 часов в присутствии или отсутствии 100ng/ml LPS или живых Lactobacillus acidophilus (1x10³ кл/мл). Культуру отмывали 3 раза эндотоксин-несодержащим PBS и далее культивировали в течение 4 часов в присутствии 1µg/ml LPS. После этого собирали супернатанты и концентрацию IL-1b и IL-10 исследовали методом иммуноферментного анализа, используя тест SET-Go (eBioscience).

Статистические данные анализировали методом GraphPad с использованием параметрических и непараметрических методов.

Результаты и обсуждение 

Как показали результаты проведенных исследований (рис.1), при стимуляции непримированных моноцитов LPS наблюдается выраженная продукция IL-1b, в то время как эндотоксиновая стимуляция LPS примированных моноцитов приводит к достоверному снижению продукции IL-1b культивируемыми моноцитами человека. Исходя из этого, можно заключить, что повторная эндотоксиновая стимуляция моноцитов индуцирует эндотоксиновую толерантность моноцитов. 

Рис.1. Индукция толерантности культивируемых моноцитов человека

На рис.2 представлены результаты исследования способности живых бактерий Lactobacillus acidophilus индуцировать эндотоксиновую толерантность моноцитов периферической крови человека. Как видно из приведенных данных, примированные Lactobacillus acidophilus моноциты усиливают синтез IL-1b, в то время как эндотоксиновая стимуляция этих примированных моноцитов сопровождается достоверным снижением продукции IL-1ß. 

Рис.2. Индукция эндотоксиновой толерантности живыми бактериями 

Lactobacillus acidophilus

Далее нами был исследован возможный механизм воздействия бактерий Lactobacillus acidophilus на индукцию эндотоксиновой толерантности моноцитов. Мы предположили, что живые бактерии Lactobacillus acidophilus могут стимулировать продукцию противовоспалительных цитокинов моноцитами в течение короткого времени инкубации. Поэтому нами было исследовано влияние бактерий Lactobacillus acidophilus на продукцию IL-10 и IL-1b моноцитами периферической крови человека. Результаты проведенных исследований представлены на рис.3.

Рис.3. Влияние живых бактерий Lactobacillus acidophilus на синтез IL-1b и IL-10 моноцитами периферической крови человека

Из представленных данных следует, что инкубация низких доз живых бактерий Lactobacillus acidophilus с моноцитами повышает продукцию как IL-1ß, так и IL-10. 

Следует отметить, что молочнокислые бактерии имеют ряд преимуществ перед химиопрепаратами, так как относятся к представителям нормальной микрофлоры организма, и комплекс биологически активных соединений, синтезируемых лактобактериями, стимулирует защитные силы организма и повышает активность лимфоцитов.

Таким образом, нами разработаны условия для изучения влияния различных доз Lactobacillus acidophilus на индукцию эндотоксиновой толерантности культивируемых моноцитов человека.

Показано, что инкубация живых бактерий Lactobacillus acidophilus с моноцитами повышает продукцию IL-1b и IL-10. 

Поступила 09.08.10

Литература

1. Абелев Г.И.  Основы иммунитета. М., 1996.
2. Галактионов В.Г.  Иммунология, М., 1998.
3. Hanson C.V., Nishiyama Y., Paul S. Catalytic antibodies and their applications. Curr. Opin. Biotechnol., 2005, 16(6):631-637. 
4. Jeneway Ch.A., Travers P.  Immunology. 1994.
5. Klein A., Friedrich U., Vogelsang H., Jahreis G. Lactobacillus acidophilus 74-2 and Bifidobacterium animalis subsp lactis DGCC 420 modulate unspecific cellular immune response in healthy adults. Eur. J. Clin. Nutr., 2008,62(5):584-593.
6. Medvedev A.E., Lentschat A., Wahl L.M., Golenbock D.T., Vogel S.N. Dysregulation of LPS-induced Toll-like receptor 4-MyD88 complex formation and IL-1 receptor-associated kinase 1 activation in endotoxin-tolerant cells. J. Immunol., 2002; 169:5209-5216.
7. Paturi G., Phillips M., Jones M., Kailasapathy K. Immune enhancing effects of Lactobacillus acidophilus LAFTI L10 and Lactobacillus paracasei LAFTI L26 in mice. Int. J. Food Microbiol., 2007,115(1):115-118. 
8. Paturi G., Phillips M., Kailasapathy K. Effect of probiotic strains Lactobacillus acidophilus LAFTI L10 and Lactobacillus paracasei LAFTI L26 on systemic immune functions and bacterial translocation in mice. J. Food Prot., 2008,71(4):796-801. 

Вопросы, ответы, комментарии