Исследование фармакокинетики метронидазола в крови и слюне

Ключевые слова: метронидазол, фармакокинетика, слюна

Слюна как матрица для определения уровня биологически активных соединений привлекает внимание исследователей уже более 80 лет. Определение в слюне содержания  лизоцима, гормонов, иммуноглобулинов, микроэлементов уже давно используется для диагностики многих заболеваний, в том числе рака и СПИДа [14]. Последние 30 лет популярными стали также исследования фармакокинетики лекарств на основе регистрации их концентрации в слюне. Использование слюны вместо крови оказалось достаточно информативным и полезным при проведении мониторинга терапии некоторых лекарств и исследовании фармакокинетики у амбулаторных пациентов, особенно в детском и пожилом возрасте [1-3,13-15]. 

Основной предпосылкой для использования слюны в фармакокинетических исследованиях является наличие данных о том, что концентрация лекарства в слюне примерно равна его концентрации в крови, от которой зависит выраженность терапевтического и токсического действия препарата [4, 13]. Не менее важным является наличие стабильного соотношения концентраций в слюне и крови, причем желательно, чтобы это соотношение не зависело от возраста и пола пациентов [1,2,4]. В настоящее время рекомендуется использовать слюну для исследования  фармакокинетики тех соединений, которые проникают в слюну и не связываются с каким- либо элементом слюны, не подвергаются разрушению ферментами слюны, и степень проникновения которых в слюну не зависит от рН слюны [4,13].

К препаратам данного класса принадлежит и метронидазол. Метронидазол характеризуется высокой растворимостью и проницаемостью, быстро и полностью всасывается в кровь из желудочно-кишечного тракта [7,9]. Величина pKa метронидазола составляет 2,44, это свидетельствует о том, что при физиологическом рН он может легко проникать в слюну [4, 6]. Установлено, что концентрация метронидазола в слюне и крови в интервале 0-6 часов после его приема внутрь примерно одинакова [10,11,16]. Однако до настоящего времени не выявлен оптимальный график отбора проб слюны, который позволил бы использовать слюну для исследования биоэквивалентности метронидазола. 

Учитывая то, что ранее нами был разработан и валидирован удобный метод определения метронидазола в слюне и плазме крови [5], представляет несомненный интерес исследование фармакокинетики метронидазола на основе регистрации его концентрации в слюне и крови с целью разработки оптимальной модели использования слюны для исследования фармакокинетики и биоэквивалентности метронидазола. 

Цель настоящей работы – разработка оптимальной модели использования слюны для исследования фармакокинетики и биоэквивалентности метронидазола.

Материал и методы

В работе был использован зарегистрированный в Армении  препарат «Клион» производства фирмы «Гедеон Рихтер А.О.» (Венгрия), содержащий 250 мг метронидазола. Исследование фармакокинетики метронидазола было проведено у 3 здоровых добровольцев женского пола, давших письменное информированное согласие на участие в эксперименте. Возраст добровольцев 31, 29 и 19 лет, индекс массы тела 19; 23,8 и 20 кг/м². Питание на протяжении исследования было стандартизировано. На проведение исследования было получено разрешение Этического комитета МЗ РА и Научного центра экспертизы лекарств и медицинских технологий МЗ РА. 

Добровольцы принимали одну таблетку метронидазола утром, натощак, запивая ее 200 мл воды. Доза метронидазола составляла 250 мг. Слюну  и кровь отбирали до приема (0 час) и через 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 8 и 24 часа после приема препарата. Отобранную слюну (1-2 мл) фильтровали, полученные фильтраты содержались в холодильнике при температуре –20ºC до момента проведения анализов. Кровь (6-8 мл) отбиралась в стандартные гепаринизированные пробирки на 10 мл из локтевой вены. Отобранный образец крови подвергался центрифугированию при 600g в течение 15 мин для отделения плазмы, и образцы плазмы помещались в холодильник, где содержались при  температуре –20ºC до момента проведения анализов.

Количественное определение метронидазола в слюне и крови проводили по следующим схемам.

Схема анализа образцов слюны. К 0,2 мл слюны добавлялось 0,1 мл метанола и метилстеарата (внутренний стандарт, 100 мкг/мл) в метаноле. После перемешивания к смеси добавлялось 2,0 мл метанола, смесь интенсивно встряхивалась в течение 1 мин, центрифугировалась при 600g в течение 5 мин для осаждения белков. Безбелковый супернатант отделялся  и упаривался досуха на роторном испарителе при температуре 50ºС, остаток растворялся в 100 мкл уксусного ангидрида и выдерживался при температуре 70ºС в течение 20 мин,  после чего из полученной смеси отбирали 2 мкл и вводили в  хроматограф. Хроматографическое определение метронидазола проводилось на приборе Кристалл 2000М, производства фирмы «Хроматек» (Россия) в следующих условиях: колонка – кварцевая капиллярная – DB-5 (30 м x 0,25 мкм x 0,25 мкм), детектор – пламенно-ионизационный, газ-носитель – азот, скорость потока – 40 мл/мин, деление потока – 1:20, температура испарителя – 250ºС, температура детектора – 280ºС, температура колонки менялась от 100 до 280ºС со скоростью 10ºС/мин, объем вводимой пробы составлял 1 мкл, время анализа – 20 минут. 

Схема анализа образцов плазмы крови. К 0,5 мл плазмы крови добавлялось 0,4 мл метанола и метилстеарата (внутренний стандарт, 100 мкг/мл) в метаноле. Смесь перемешивалась и центрифугировалась при 2000g в течение 5 мин для освобождения от белков. Полученный безбелковый супернатант анализировали методом, описанным для слюны.

Степень извлечения метронидазола составляла 97,5%, точность метода - 97±2%, систематическая погрешность метода не более 3%. Предел обнаружения метронидазола в слюне составлял 0,2 мкг/мл. Метод сохранял линейность в диапазоне концентрации метронидазола от 0,2 до 20 мкг/мл. Специфичность, повторяемость и воспроизводимость метода характеризовались коэффициентом вариации менее 5%, что соответствует валидационным требованиям для методов определения препаратов в биожидкостях.

Расчет фармакокинетических параметров исследуемых препаратов был проведен с помощью известной фармакокинетической программы Kineticа 4.4.1 (Termo Corporation, 2004). Определялись следующие фармакокинетические параметры: C_max – максимальная концентрация препарата (мкг/мл); t_max – время достижения максимальной концентрации (час); AUC_0-t – площадь под фармакокинетической кривой в диапазоне от 0 до последней экспериментальной точки на кривой (мкг · час/мл); AUC_0-– общая площадь под фармакокинетической кривой=AUC_0-t+C_t/ К_el, где C_t – последняя зарегистрированная концентрация (мкг · час/мл); t_1/2 – период полувыведения (час).

Статистический анализ был выполнен при помощи компьютерной программы Statistic for Windows, version 6.0. Все статистические расчеты проводились для 95% доверительного интервала. Все полученные  результаты анализировались методами описательной статистики, с расчетом значений среднего, стандартного отклонения и коэффициента вариации.

Результаты и обсуждение

В результате фармакокинетических исследований было установлено, что максимальная концентрация метронидазола в слюне и плазме крови достигается через 1 час после введения исследуемых препаратов и составляет 13,3±0,9 и 13,2±0,7 мкг/мл соответственно. Сразу после достижения максимума,  уровень метронидазола в плазме крови экспоненциально уменьшается и через 24 часа концентрация метронидазола в плазме крови примерно одинакова в обеих биожидкостях и составляет примерно 0,5 мкг/мл (рисунок).

Рисунок.  Сравнительный анализ изменения концентрации метронидазола в слюне и крови добровольцев 

Сравнительный анализ изменения концентрации метронидазола в слюне и крови добровольцев показал, что в интервале 0,5-8 час соотношение концентрации метронидазола в слюне и крови добровольцев практически одинаково и составляет 0,93±0,02, что близко к литературным данным 0,87-1,03 [8-11,16]. В то же время через 24 часа величина соотношения слюна/кровь достоверно ниже, чем в интервале 0,5-8 часов  и составляет 0,82±0,04 (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительный анализ изменения концентрации метронидазола в слюне и крови добровольцев.

Статистический анализ фармакокинетических параметров метронидазола, полученных при анализе изменения его концентрации в слюне и крови в интервале 0-8 часов и 0-24 часа после приема препарата, приведен в табл. 2 и 3.

Как видно из табл. 2 и 3 фармакокинетические параметры метронидазола, полученные после анализа изменения его концентрации в слюне и крови, примерно одинаковы. Вместе с тем необходимо отметить, что скорость выведения метронидазола из слюны несколько выше, чем из крови, независимо от продолжительности отбора проб. Однако при отборе проб в интервале 0-8 часов разница в величинах t1/2, в слюне и крови несколько меньше и составляет -0,056±0,11, тогда как при использовании интервала 0-24 часа  -0,221± 0,07(табл.2). 

Таблица 2

Статистический  анализ  фармакокинетических параметров метронидазола, полученных после анализа изменения его концентрации в слюне и крови в интервале. 0-24 часа после приема препарата

Таблица 3

Статистический  анализ  фармакокинетических параметров метронидазола, полученных после анализа изменения его концентрации в слюне и крови в интервале 0-8 часов после приема препарата 

Как видно из таблиц,  после анализа изменения его концентрации в слюне и крови в интервале 0-24 часа в величинах основных фармакокинетических параметров метронидазола, за исключением C_max,  наблюдаются статистически достоверные различия.

Наиболее выраженные отличия отмечены для значения AUC_0- (Р=0,081), которое является профилирующим фармакокинетическим параметром при исследованиях биоэквивалентности [11,12,16]. В то же время при анализе изменения его концентрации в слюне и крови в интервале 0-8 часов фармакокинетические параметры метронидазола статистически не отличаются (табл. 3).

полученные результаты коррелируют с литературными данными. Так, в исследованиях M. Van Oosten et al. (1986)  было обнаружено, что после приема внутрь 750 мг метронидазола, наибольшая разница в концентрациях метронидазола в слюне и крови регистрировалась через 24 час и составляла 15% (соотношение слюна/кровь 0,85), тогда как в интервале 0-12 часов она не превышала 10% [16].

Учитывая то, что при использовании интервала 0-8 часов величина интерполируемого участка фармакокинетической кривой препарата составляет примерно 6%, что удовлетворяет требованиям по изучению биоэквивалентности (›20%) [12,13], можно заключить, что использование данного интервала достаточно для получения достоверных результатов при исследовании биоэквивалентности и фармакокинетики метронидазола. Отбор проб на протяжении 24  часов, хотя и является более правильным при изучении фармакокинетики метронидазола с использованием крови, однако не представляется приемлемым для слюны, так как  в этом случае концентрация в слюне не будет правильно отображать уровень метронидазола  в крови. 

Одной из причин изменения соотношений концентраций метронидазола в слюне и крови через 24 часа после приема, вероятно, может быть изменение скорости слюнообразования в течение ночи, как это наблюдалось в случае с фенитоином [8].  

Таким образом, можно заключить, что оптимальной моделью использования слюны для исследований фармакокинетики и биоэквивалентности метронидазола является изучение изменения концентрации препарата в слюне в интервале 0-8 часов, когда соотношение уровня в слюне и крови практически не изменяется. 

Поступила 03.02.10

Литература 

1. Азатян С.М., Оганесян А.C. Габриелян Э.С. Оптимизация фармакотерапии некоторыми противоэпилептическими препаратами на  основе изучения их фармакокинетики в слюне больных. Фармация. М., 1998, 6, с. 20-23.
2. Григорян С.В., Казарян А.В., Оганесян А.C. Суточные изменения фармакокинетики пропроналола в слюне больных с электрасистолической аритмией. Научные труды и сообщения НИЗ РА. 1998, с. 110-114.
3. Оганесян А.C. Исследование возможности использования слюны для оптимизации фармакотерапии хинидина. Вестник МАНЭБ, 2004, т.9, 4, с.110-114.
4. Холодов Л.Е., Яковлев В.П. Клиническая фармакокинетика. М., 1985, с. 177-187. 
5. Хуршудян К.Л., Оганесян А.С., Мелконян М.А. Разработка и валидация количественного определения метронидазола в слюне методом газовой хроматографии. Материалы 4-й  Международной конференции  ”Современные аспекты реабилитации в медицине”. Агверан, 22-24 сентября, 2009, с. 286-288.
6. Emami J.,  Ghassami N., Hamishehkar H A Rapid and sensitive HPLC method for the analysis of metronidazole in human plasma: application to single dose pharmacokinetic and bioequivalence studies. DARU, 2006, 14, 1, p. 14-19.
7. Jensen J.C., Gugler R. Single and multiple-dose metronidazole kinetics. Clin.Pharm.Ther. 1983, 34, p. 481-487.
8. Kamali F., Thomas S.H. Effect of saliva flow rate on saliva phenytoin concentrations: implications for therapeutic monitoring. Eur. J. Clin. Pharmacol., 1994, 5, p. 565-567.
9. Kaye C.M., Sankey M.G., Thomas L.A. A rapid and specific semi-micro method involving high-pressure liquid chromatography for the assay of metronidazole in plasma, saliva, serum, urine and whole blood. Br. J. Clin. Pharmarol., 1980, v.9, p. 528-529. 
10. Mustofa А., Suryawati S., Santoso B. Pharmacokinetics of metronidazole in saliva. Int. J. Clin., Pharmacol. Ther. Toxicol., 1991,v.29, p. 474-488.
11. Pдhkla E.R. , Koppel T. , Saag M.,  Pдhkla R. Metronidazole concentrations in plasma, saliva and periodontal pockets in patients with periodontitis. Journal of Clinical Periodontology, 2005, v. 32,2, p. 163-166.
12. Ritschel W.A. Handbook of Basic Pharmacokinetics. 5th Ed., Cincinnati, 1995, p. 130-135. 
13. Rockville M.D. FDA guidance on statistical procedures for bioequivalence studies using a standard two-treatment crossover designs, Division of Bioequivalence, office of Generic Drugs, Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration; 1992.
14. Saliva as a Diagnostic fluid. Ed. D.Malamud and L. Tabak, Annals of the NY Academy of sciences, v. 694, NY, 1993, 347 p.
15. Ueda C.T., Beckmann P.J., Dzindizo B.S. Relationship between saliva and serum quinidine concentration and suppression of ventricular premature beats. Ther. Drug Monitor., 1984, 6, p.43-49.
16. Van Oosten M.A.C., Notten F.J.W,  Mikx F.H.M.  Metronidazole Concentrations in Human Plasma, Saliva, and Gingival Crevice Fluid after a Single Dose. J. Dent. Res., 1986, 65, p.1420.

Вопросы, ответы, комментарии