Med-Practic
Посвящается выдающемуся педагогу Григору Шагяну

События

Анонс

У нас в гостях

Aктуальная тема

Медицинская наука Армении 3.2009

Участие окиси азота в регуляции азотистого обмена в печени

Ключевые слова: окись азота, гипераммонемия, синтез мочевины, NOS, L-NAME, печень

Асканиа Собреро в1846 г. впервые синтезировал нитроглицерин. В 1879 г. Вильям Мюррель опубликовал статью о том, что нитроглицерин можно использовать в качестве лечебного средства при стенокардии с целью борьбы с болевым синдромом. По автору, нитроглицерин оказывает  расширяющее действие на артерии сердца, вследствие чего растёт снабжение сердечной ткани кислородом. По иронии судьбы, Мюррель скончался в 1912 г. от нелеченого сердечного недуга,  так   ни разу не приняв нитроглицерин  [12].

 

Спустя 100 лет после публикации Мюрреля выяснилось, что эндотелиальным релаксирующим фактором артерии и вен является окись азота, которая выделяется из   нитроглицерина при его per os применении, и механизм его действия связан со стимулированием синтеза циклического гуанозин монофосфата (cGMP) [15, 16, 23, 30]. Окись азота – свободный радикал, являющийся производным  азота с неспаренным, непарным электроном (N=O). Это соединение образуется в эндотелиоцитах кровеносных сосудов, центральной и периферической нервной системе (нейронах, астроцитах и микроглии), печени (гепатоцитах, периферической зоне печеночных ацинусов, ядрах    гепатоцитов), почках и других органах и тканях [9, 32].

 

NO является мессенджером между нервными клетками и связан с процессами обучения, памяти, сна, боли и др. [9, 13, 29]. NO – универсальный регуляторный фактор в организме,  выполняет роль внутри-  и внеклеточного передатчика. Сегодня трудно назвать функцию организма, в регуляции которой NO не принимало бы участия. NO синтезируется в ответ на  физиологические потребности NO синтазой (NOS) из аргинина. NADPH, FMN, FAD и тетрагидробиоптерин служат кофакторами [4, 16-18, 40, 42]. Существуют 3 изоформы NOS: нейрональная (nNOS), эндотелиальная (eNOS) и индуцибельная ( iNOS) [6, 29].

 

Способность NO давать физиологический эффект в большей степени зависит  от малой величины его молекулы, его высокой реактивности и способности к свободной диффузии в различные ткани [4,34]. При низкой концентрации (10-100 nМ)  NO обеспечивает физиологические процессы, а при увеличении до 2-4 mкМ и более – проявляется токсическое действие вследствие  образования из него высокотоксичных соединений и агрессивных  свободных радикалов (ONOO., HО., H., NO2 +  и др.) [4,24].

 

При патологических состояниях мозга и  печени и экспериментальной гипераммонемии происходит активирование NMDA  рецепторов, что приводит к активированию NOS,образованию NO,  нитрированию или нитрозилированию различных белков  и ферментов, в том числе глутаминсинтетазы, и их ингибированию. Ингибирование NOS повышает активность глутаминсинтетазы и способствует устранению аммиака и снижению его токсического действия [14, 25].

 

Токсичность аммиака впервые была выявлена в лаборатории И.П.Павлова [19]. При гепатитах, циррозе и других заболеваниях печени активность глутаминсинтетазы и ферментов цикла мочевины значительно снижается [20], в результате чего содержание аммиака повышается более чем на  1 mМ и выбрасывается в кровяное русло, через которое проникает  в мозг, оказывает свое токсическое действие стимулированием NMDA  рецепторов, повышает синтез NO. Через образование токсических интермедиатов NO становится причиной отека мозга [39], энцефалопатии  [10]  и различных  неврологических заболеваний вплоть до болезни Альцгеймера [9, 22].

 

В этом отношении представляло интерес изучение синтеза мочевины в печени при аммонийной интоксикации, а также в присутствии глутамина, и предотвращение вызванных ими  патологических процессов под действием ингибитора  NOS L-NAME.

 

Материал и методы

 

Опыты были поставлены на половозрелых белых крысах популяции Вистар массой 120-130г. В in vivo опытах контрольной группе   в/б вводили физ. раствор, второй группе  – L-NAME 75 мг/кг, третьей  – 7 mМ/кг NH4Cl, четвёртой группе – L-NAME  и через 10 мин – NH4Cl, а через 15 мин животных быстро декапитировали и определяли соответствующие  ингредиенты в указанных органах. В in vitro опытах животных быстро декапитировали, извлекали печень и после удаления кровеносных сосудов и остатков крови  готовили 10% гомогенат в К-фосфатном буфере (mМ): KH2PO4-K2HPO4 – 16, MgSO – 5, KCl – 20 и NaCl – 76. Молярность буфера доводили сахарозой до 0,32 М. Для каждой пробы брали 2 мл гомогената. В in vitro опытах использовали 0.21 mМ  NH4Cl, 3 mМ глутамина, 1 mМ L-NAME. Реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 37оС в атмосфере воздуха. По окончании инкубации белки осаждали 40% трихлоруксусной кислотой (конечная концентрация составляла 4%). Спустя 30 мин пробы центрифугировали при 3,5 тыс. об/мин в центрифуге К-24 в течение 15 мин. В надосадочной жидкости определяли содержание аммиака и глутамина микродиффузионным методом [5]. Белок определяли по Лоури и соавт. [28], мочевину – уреазным   методом [35]. Указанные реактивы были приобретены из  Sigma Chemical Company, остальные являлись коммерческими.

 

Результаты и обсуждение

 

Известно, что основным механизмом устранения аммиака в организме   является синтез мочевины,который происходит,в основном, в печени. Другим механизмом обезвреживания аммиака является синтез глутамина, который, главным образом, происходит в мозгу и мышцах. Наши прежние исследования показали, что под действием   ингибитора  NOS  аминогуанидина содержание эндогенного аммиака в мозгу значительно снижается, что расходуется на синтез глутамина [ 2]. В печеночной ткани под действием  L-NAME окисление NADPH подавляясь, снижает дезаминирующую активность глутаматдегидрогеназы,  и создаются условия для синтеза глутамата с использованием аммиака [3]. Проведенные нами исследования показали (табл. 1), что в in vivo

 

Таблица 1

Влияние NH4Cl  и L-NAME на количество  аммиака и мочевины 

(gN/100 мг белка) в печени крыс в in vivo опытах

 * Азот аммиака  + азот мочевины

** Здесь и в последующих таблицах у р указаны номера сравниваемых вариантов   эксперимента

 

опытах содержание аммиака (gN/100 мг белка) в печени крыс контрольной группы составляет 64,72 ± 2,26. Под действием   ингибитора  NOS  L-NAME его количество не подвергается особым изменениям. Внутрибрюшинное введение аммиака (7 mМ/кг) в виде NH4Cl  приводит к резкому увеличению его количества (на 51,92%). В этих условиях животные впадали в коматозное состояние.  При введении ингибитора  NOS  L-NAME  за 10 мин до введения NH4Cl животные внешне выглядели нормально, коматозное состояние предотвращалось. Содержание аммиака заметно снижалось. Действие L-NAME можно объяснить ингибированием  NOS, снижением уровня NO  и предотвращением образования токсических продуктов метаболизма NO, денитрированием или денитрозилированием глутаминсинтетазы и активированием  синтеза глутамина [2, 14, 25]. Устранение аммиака в in vivo условиях могло происходить через синтез мочевины. В наших экспериментах под действием L-NAME в присутствии  NH4Cl  количество  мочевины лишь несколько увеличивается, что в in vivo экспериментах можно объяснить удалением части образовавшейся мочевины почками.

 

Таблица 2

Влияние NH4Cl  и L-NAME  на количество  аммиака и мочевины 

(gN/100мг белка) в головном мозгу  крыс в in vivo опытах

В головном мозгу в   условиях in vivo   в контроле содержание эндогенного аммиака составляет 108.38 (табл. 2).  На этом фоне L-NAME не оказывает особого влияния на содержание аммиака. NH4Cl  значительно увеличивает (на 31,02%) количество  аммиака в  мозгу (P‹0,001). При введении   L-NAME  за 10 мин до введения NH4Cl количество  аммиака снижается ( P‹0,001), который, вероятно,   используется для  синтеза глутамина [2]. Количество  мочевины в присутствии NH4Cl несколько снижается. В этих условиях L-NAME четко увеличивает (на 18,94%) содержание мочевины (табл. 2), что, вероятно, связано с её защитной функцией.  

 

В  следующей  серии in vitro мы изучили накопление аммиака и синтез мочевины в печеночной ткани при  экспериментальном

 

Таблица 3

Накопление аммиака и синтез мочевины(gN/100мг белка)  в гомогенатах печени крыс при экспериментальном гипераммонемическом синдроме

 гипераммонемическом синдроме, вызванном аммоний хлоридом (табл. 3). Исследования показали, что содержание  эндогенного аммиака в гомогенатах печени составляет 81,15.  При 30 мин инкубации его количество  увеличивается, составляя 125,94 (P‹0,001). Под действием L-NAME (1 mМ) образование аммиака снижается до 110,69 (P‹0,001),что можно объяснить синтезом глутамина [2,14,25]. При добавлении к инкубационной среде 0.21mМ NH4Cl  количество свободного аммиака увеличивается, составляя 165,48 (P‹0,001). В присутствии NH4Cl L-NAME приводит к некоторому снижению содержания аммиака.

 

При инкубации гомогенатов печени количество эндогенной мочевины четко снижается (на 24,57%,P‹0,001),вероятно, связываясь с частицами гомогената,  выпадает в осадок.Под действием L-NAME наблюдается тенденция к снижению количества  эндогенной мочевины. При гипераммонемии (добавление NH4Cl) не происходит синтеза мочевины, а в присутствии L-NAME отмечается  лишь тенденция к ее снижению. Следует иметь в виду, что при гипераммонемии в условиях in vivo и in vitro  нарушается мочевинообразование вследствие подавления цикла трикарбоновых кислот [26, 38] и снижения  синтеза ATP [14, 25]. Учитывая это обстоятельство, при изучении синтеза мочевины используют различные  активаторы для стимулирования   мочевинообразования [1].

 

Таблица 4

Накопление аммиака и синтез мочевых (gN/100 мг белка)

из глутамина в гомогенатах печени крыс

 

В следующей серии мы использовали в качестве источника аммиака глутамин  (табл. 4).  Исследования показали, что и в этой серии количество эндогенного аммиака при инкубировании значительно увеличивается (на 82,92%), и под действием L-NAME  тенденция к снижению его количества сохраняется. При добавлении к инкубационной среде глутамина количество аммиака увеличивается (P‹0,001).  L-NAME несколько снижает образование аммиака из глутамина (P‹0,025). Снижение количества  эндогенной мочевины при инкубировании и в этой серии повторяется (P‹0,001).  Под действием  L-NAME количество мочевины четко снижается, что можно объяснить усилением синтеза глутамина [2]. Примечательно, что в присутствии глутамина выраженно увеличивается синтез мочевины (на 15,8%, P4/2‹0,005).  На этом фоне L-NAME   четко подавляет синтез мочевины(на 35,47%, P5/4‹0,001). Можно допустить, что в этих условиях образовавшийся из глутамина  аммиак  вновь  расходуется на синтез глутамина вследствие активирования глутаминсинтетазы денитрированием или денитрозилированием  [2, 14, 25]. Таким образом, в отличие от гипераммонемии, вызванной NH4Cl (табл.3), в присутствии глутамина четко стимулируется синтез мочевины (табл.4), вероятно, из-за постепенного высвобождения аммиака из глутамина. Токсический эффект аммиака связан с активированием NMDA рецепторов, синтезом NO и токсических продуктов его метаболизма, а не ингибированием   глутаминсинтетазы [14, 25].

 

 Впервые в 1964 г. было показано, что метионинсульфоксимин (MS) является ингибитором глутаминсинтетазы [41]. Однако данные о том, что MS, ингибируя синтез глутамина, предотвращает  гибель животных, не подтвердились. После появления работ о том, что MS ингибирует высвобождение глутамата, стало ясно, что MS оказывает свое действие через ингибирование NMDA рецепторов вследствие снижения количества глутамата [37]. Тем не менее продолжаются исследования относительно ингибирующего действия MS на глутаминсинтетазу [21].

 

Попытка применения антагониста NMDA рецептора MК-801 с лечебной целью выявила и его токсическое действие, механизм которого  предстоит выяснить [8]. При циррозе печени содержание NO увеличивается под действием  еNOS в эндотелиальных   клетках  и iNOS в сосудистых стенках и клетках под действием  цитокинов  и эндотоксинов  [7].  iNOS, который является Са2+-независимым, оказывает положительную роль в борьбе с инфекциями в сосудистых стенках, гепатоцитах  и купферовских клетках [27]. У печеночных больных увеличивается и количество цитруллина, вероятно, из-за ослабления синтеза  мочевины [36]. NO играет ведущую роль в развитии артериальной вазодилатации [7].

 

Показано, что при циррозе печени избыточное количество  NO   выбрасывается в альвеолы, затем в респираторный тракт, где оказывает  защитное действие в борьбе с различными инфекциями [11, 31].При этаноловом циррозе снижается образование NO в непаренхимальных клетках и компенсаторно повышается  в гепатоцитах, что можно объяснить проявлением защитной функции при этой патологии [33].

 

В заключение следует отметить, что при различных патологиях печени и экспериментальном гипераммонемическом синдроме имеет место токсическое действие аммиака с тяжелыми последствиями(гибель нейронов,нейродегенеративные заболевания, глубокие поражения печеночной ткани). Возникает необходимость поиска безвредных средств повышения эффективности циклов трикарбоновых кислот и мочевинообразования, а также ингибиторов NOS, активаторов глутаминсинтетазы и внедрения их в клиническую  практику с  целью борьбы с гипераммонемическим синдромом и его последствиями.

 

Литература

 

  1. Бунятян Г. Х., Давтян М.А. Вопросы биохимии мозга, 1964, т.1, с.97-104.
  2. Мисакян Г.С., Паронян Ж.А., Туршян Г.А., Априкян Г.В. Мед. наука Армении НАН РА, 2006, т. XLVI, 2,  с.18-22.
  3. Паронян Ж.А., Мисакян Г.С., Туршян Г.А., Априкян Г.В. ДНАН Армении, 2007, т.107, 1, с.79-86.
  4. Раевский К.С., Башкатова В.Г.,  Ванин А.Ф. Вестник Российской АМН, 2000, т.4, с.11-15.
  5. Силакова А.И., Труш Г.Р., Явилякова А. Проблемы медицинской химии, 1962, т.5, с.538-543.
  6. Alderton W.K.,Cooper C.A., Knowles R.G. Biochem. J., 2001, 357, p.593-615.
  7. Atucha N.M., Nadal F.J.A., Lyu D., Alcaraz A. et al. Current Vascular Pharmacology, 2005, 3, p. 81-85.  
  8. Brenner E., Kondziella D., Haberg A., Sonnewald U.  J.Neurochem., 2005, 94, p.1594-1603.
  9. Bruhwyler J.,Chleide E., Liegeois J.F., Carreer F.  Neurosci .Behav. Rev., 1993, 17, p.373-385.
  10. Clemmensen J.O., Larsen F.S., Kondrup J.et al. Hepatology, 1999, 29, p. 648-653.
  11. Delclaux C.,Mahut B., Zerah-Lancner F. et al.  Am.  J.Respir.  Crit. Care Med., 2002, 165, (3),   p. 332-337.
  12. Devlin Th.M., ed.In: Textbook of Biochemistry, USA, 2006, p.438.
  13. Dawson T.M., Dawson V.L.,Snyder S.H. Ann.Neurol., 1992, 32, p.297-311.
  14. Felipo V., Butterworth R.F.  Progress in Neurobiology, 2002, 67, p.259-279.
  15. Furchgott R.F., Zawadzki I.V.  Nature , 1980, 288, p.373-376.
  16. Garthwaite J.,  Charles S.L., Chess-Williams R. Nature, 1988, 336, p.385-388.
  17. Garthwaite J., Garthwaite G.,Palmer R.C.,  Moncada S.Eur. J.Pharmacol., 1989, 172, p.413-416.
  18. Griffith O.W., Stuchr D.J.  Annu.Rev. Physiol.,1995, 57, p.707.
  19. Hahn M.,  Massen O., Nenchi M., Pavlov I.  Arch.Exp.Path.Pharmac., 1893, 32, p.161-173.
  20. Haussinger D. Eur. J .Biochem., 1983, 133, p.269-275.
  21. Hawkins A., Jessy J., Mans A.M., De Josef M.R. J.Neurochem.,1993, 60, p.1000-1006.
  22. Heales S.J.R.,Bolonos J.P.,Stewart V.C.et al.Biochim.Biophys.Acta, 1999, 1410, p. 215-228.
  23. Ignarro L.J.,Buga G.M.,Wood K.M. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1987,  84, p. 9265.
  24. Ischiropoulos H., Zhu L., Beckman J.S. Arch.Biochem.Biophys., 1992, 298, p.446-451.
  25. Kosenko E., Liansola M., Montoliu C. et al.Neurochem Internat.,  2003, 43, p.493-499.
  26. Kosenko E., Felipo V., Grisolia S., Kaminsky Y.Metab.Brain Dis.,1996, 12, (1), p.69-82.
  27. Li J., Billiar T.R. Am. J. Physiol. Gastrointest. and Liver Physiol., 1999, 276, (5), PG1069-G1073.
  28. Lowry O.H.,  Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J.   J.Biol.Chem., 1951, 193, p.265-267.
  29. Lincoln J., Hoyle C.H.V., Burnstock G.In: Nitric Oxide in Health and Disease. Biochemical Research Topics. Cambridge University Press, 1997.
  30. Murad F., Kimura H. Life Science, 1975, 17(6), p.837-843.
  31. Matsumoto A., Ogura K., Hirata Y.et al. Annals Internal Medicine, 1995, 123, (2), p.110-113.
  32. McNaughton L., Puttagunda L., Martinez–Cuesta M.A.et al. PNAS, 2002, 99, (26), p.17161-17166.
  33. Naji A.A., Greenberg G.S., Tahan S.R. et al.Gastroenterology,  1995 , 109, (3), p.899-907.
  34. Nelson R.J., Krieqsfeld L.J.,  Dawson  V.L., Dawson T.M. Front Neuroendocrinol., 1997, 18, (4), p.463-491.
  35. Okuda H., Fujii S., Kawashima Y.Tokushima J.Experim. Medicine, 1965, 12, (1), p.11-23.
  36. Parva A.E., Negrean V., Pleca-Manea L. et al.Romanian J.Gastroenterology, 2005, 14, (3), p.225-230. 
  37. Paulson R.E., Fonnum F. J.Neurochem., 1989, 52, p.1823-1829.
  38. Ratnakumari L.,Qureshi I.A.,Butterworth R.F. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1992, 184, p.740-751.
  39. Swain M., Butterworth R.E., Blei A.T. Hepatology, 1992, 15, p.449-453.
  40. Schmidt H.H.H., Hofmann H., Ogilvie P. In: The role of nitric oxide in physiology and pathophysiology. Eds. by Korowski H. and Nacada H., Berlin, Heidelberg, 1995, p.75-86.
  41. Warren K.S., Schenker S.  J.Lab.Clin. Med., 1964, 64, p.442-449.
  42. Yamada K., Nabeshima T. Neurosci.Res., 1997, 28, p.93-102.

Автор. Ж.А.Паронян, Г.А.Туршян, Н.В. Кочарян, Г.С.Мисакян, Г.В.Априкян Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна НАН РА 0014, Ереван, ул.П. Севака, 5/1 УДК 611.85461711
Источник. Медицинская наука Армении 3.2009
Информация. med-practic.com
Авторские права на статью (при отметке другого источника - электронной версии) принадлежат сайту www.med-practic.com
Share |

Вопросы, ответы, комментарии

Читайте также

Синдром Бругада и соединительнотканая дисплазия

Ключевые слова: синдром Бругада, внезапная смерть, аритмия, распространенность, электрокардиограмма, соединительнотканая дисплазия

Впервые в научной медицинской литературе появилась информация о синдроме Бругада в 1992 году, когда братья Pedro и Josef Brugada опубликовали особенности клинико-кардиографического синдрома у 8 пациентов (6 мужчин и 2 женщины)...

Генетика Кардиология, ангиология
Роль некоторых факторов воспаления в патогенезе периодической болезни

Ключевые слова: интерлейкины, острофазовый ответ, альдостерон, катехоламины, этиохоланолон, воспаление, оксидантный стресс

Периодическая болезнь (ПБ) – наследственное аутовоспалительное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования...

Системные заболевания
Различия в толерантности металлопротеинов анти- и прооксидантной активности крови крыс после аэробного инкубирования крови с циклофосфамидом (Теоретическая и профилактическая медицина)

Ключевые слова: циклофосфамид, металлопротеины, ткань, крысы (самки, самцы) 

Патофизиологические механизмы действия циклофосфамида (ЦФ) в основном обусловлены продуцированием активных форм кислорода (АФК), которые вызывают геморрагический цистит...

Фармакология
Микроэлектрофизиологическое исследование влияния малых доз комплекса минеральных вод России на фоновую электрическую активность одиночных мотонейронов спинного мозга крыс в условиях экспериментального гипертиреоза

Ключевые слова: гипертиреоз, минеральные воды, фоновая активность, мотонейроны, спинной мозг

Оздоравливающее действие минеральной воды на организм человека, её лечебные свойства известны людям с глубокой древности. Лечебные водные процедуры...

Неврология Физиотерапия
Социологические и психосоциальные проблемы врача-онколога (Клиническая медицина)

Ключевые слова: онкология, психология, социология медицины, стресс,социальная адаптация, психологическая защита, законодательные акты  

Социология медицины – это отрасль социологии, изучающая взаимосвязи и взаимоотношения в системе медицина–общество. Она является относительно молодой наукой...

Онкология
Эпидемиологические аспекты иерсиниозов в Армении

Ключевые слова: Yersinia enterocolitica, эпидемиология, распространенность, факторы передачи

Одно из ведущих мест в структуре этиологически нерасшифрованных кишечных нозоформ, равно как и среди трудно диагностируемых инфекций, занимает в Армении иерсиниоз...

Инфекционные болезни
Влияние некоторых социально-биологических факторов на раннюю манифестацию периодической болезни у детей в Армении

Ключевые слова: периодическая болезнь, дети, факторы риска ранней манифестации, пол, масса тела при рождении, возраст родителей, длительность грудного вскармливания, генетические и внешнесредовые модифицирующие факторы

Аутосомно-рецессивно наследуемая периодическая болезнь (ПБ), или семейная средиземноморская лихорадка (Familial Medirerranean Fever, FMF; ОMIM 249100)...

Системные заболевания Детские болезни
Изучение антирадикальной активности некоторых лекарственных и пищевых растений

Ключевые слова: кислородный стресс, антирадикальная активность, фенольные соединения, природные антиоксиданты, нейропротективная активность

Растения практически постоянно подвергаются сильному кислородному воздействию. Процесс фотосинтеза является оксигенным...

Статьи разное Фармакология
Новые возможности применения крайне высокочастотных волн в профилактике послеоперационных воспалений при экстракциях катаракты

Ключевые слова: крайне высокочастотные волны, профилактика, воспалительные реакции

На современном этапе развития катарактальной микрохирургии все более актуальными становятся достижения максимальной послеоперационной остроты зрения с восстановлением бинокулярного зрения...

Офтальмология
Некоторые аспекты психологического состояния будущих врачей

Ключевые слова: психологические факторы здоровья, личностные характеристики, тревожность,  депрессивные состояния, эмпатийные тенденции

Адаптивность как свойство организма, характеризующееся успешностью приспособления человека к различным ситуациям, их изменениям, а также эмоциональному (внутреннему или внешнему) принятию окружения...

Статьи разное
Вопросы планирования, подготовки и использования медицинских кадров (на примере Котайкского марза)

Ключевые слова: планирование медицинских кадров, заболеваемость, смертность, дефицит, дисбаланс

Формирование отечественного здравоохранения как отрасли народного хозяйства в советский период происходило в условиях достаточного или даже избыточного количества врачебных кадров...

Статьи разное
Член-корреспондент НАН РА А. М. Галстян (к 70-летию со дня рождения)
Член-корреспондент НАН РА А. М. Галстян (к 70-летию со  дня  рождения)

31 августа  2009г. исполнилось 70 лет со  дня  рождения  Айро  Михайловича  Галстяна, известного хирурга-онколога, члена-корреспондента НАН РА, профессора, заслуженного деятеля науки РА...

Врачи

Notice: Undefined index: HTTP_X_FORWARDED_FOR in /sites/med-practic.com/classes/flud_class.php on line 33

САМЫЕ ЧИТАЕМЫЕ СТАТЬИ