Влияние циклофосфамида на активность антиоксидантных и прооксидантных металлопротеинов тканей крыс ex vivo (Теоретическая и практическая медицина)

Ключевые слова: гомогенат, циклофосфамид, металлопротеины

Циклофосфамид (ЦФ) является цитостатиком и широко используется в медицине. Однако ЦФ оказывает определенные отрицательные эффекты: усиливает апоптоз  клеток костного мозга и периферических лимфоцитарных клеток, вызывает повреждение ДНК и, в целом, оксидативный стресс клеток различных тканей млекопитающих, почечную и сердечную недостаточность, подавляет продуцирование клеток крови костным мозгом, вызывая лейкопению и анемию [6,13,14,16,17,18]. С одной стороны, введенный в организм ЦФ оказывает иммунотропический эффект и иммунодефицит [11,12], повышает уровень норадреналина в клетках селезенки у BALB/c мышей [10]. Механизмы оксидативного повреждения клеток тканей крыс внутрибрюшинно введенным ЦФ in vivo ассоциированы с резким повышением прооксидантного статуса тканей крыс (кровь, печень, селезенка). С другой стороны, механизмы иммуносупрессорного подавления кислородного гомеостаза циклофосфамидом  обусловлены снижением NADPH- зависимой супероксид (O₂^-)-продуцирующей и метгемоглобин (метНb)-восстанавливающей активности изоформ цитохрома (цит) b₅₅₈ из эритроцитарных мембран (ЭМ) и мембран клеток (МК) печени и селезенки соответственно [6]. 

Если механизмы оксидативного повреждения ЦФ на организм несколько выявлены in vivo, то на тканевом уровне ex vivo эти механизмы еще не определены. Решение этой задачи облегчит и расширит определение характера факторов непосредственного воздействия ЦФ на клеточном уровне.

Целью работы являлось комплексное определение характерных изменений уровня металлопротеинов антиоксидантной активности (МАА) и металлопротеинов прооксидантной активности (МПА) тканей крыс (кровь, селезенка, костный мозг, сердце, печень и мозг) после непосредственного инкубирования  гомогенатов этих такней  с ЦФ в аэробных условиях ex vivo.   

Материал и методы

Циклофосфамид вводили в дозе 40 мг на 100 г массы белых беспородных крыс линии Вистар. Гомогенизацию тканей крыс (0,8 г костного мозга, 20 г головного мозга , 20 г сердца, 10 г селезенки, 30г печени и 20 г почки) осуществляли в 0,04 М калий фосфатном буфере, рН 7,4 (1:10 об/мин), с угловой скоростью вращения ножей гомогенизатора 1000 об/мин, в течение 2 мин при 4^о. К половине объема гомогенатов и крови (15 мл) – опытные пробы тканей (ОП), добавляли 10 мг/мл ЦФ, к контрольным пробам  (К) ЦФ не добавляли. К и ОП тканей (включая кровь) инкубировали при 4^о в течение 48 ч в аэробных условиях  ex vivo. Далее осуществляли одновременное и комплексное получение МАА и МПА из ОП и К проб тканей. 

МАА (Cu,Zn-СОД и каталаза – из цитоплазмы эритроцитов, Cu,Zn-СОД + Мn-СОД и каталаза – из цитоплазмы клеток тканей, церулоплазмин и трансферрин – из сыворотки крови) и МПА (суммарная фракция изоформ цит b₅₅₈ из сыворотки крови, эритроцитарных мембран и мембран клеток тканей, O₂^--продуцирующий липопротеин сыворотки – супрол) получали универсальным биотехнологическим способом без применения детергента для солюбилизации суммарных фракций цит b₅₅₈ ЭМ и МК тканей. Цитохром С получали из растворимой фракции гомогенатов тканей.  МАА и МПА получали из тканей, после диализа против воды и центрифугирования белковых фракций сыворотки крови, цитоплазмы эритроцитов,  белковых фракций МК и ЭМ, с дальнейшим их ионообменным хроматографированием на целлюлозах КМ-52, ДЕ-52 и суфадексе ДЕАЕ А-50 [3,4].

Количество МАА и МПА определяли оптическим спектральным методом, путем измерения плотности максимального оптического поглощения для изоформ  цит b₅₅₈ при 530 нм (бета полоса поглощения), супрола “ 430, церулоплазмина “ 610, трансферрина “ 470, цитохрома (цит) С – 520 нм. СОД активность фракций и O^-_2^-продуцирующую активность супрола  и суммарной фракции изоформ цит b₅₅₈ в гомогенной фазе определяли нитротетразолиевым синим  (НТС) методом путем вычисления процента ингибирования (для СОД) или стимулирования образования формазана при 560 нм (для супрола или цит b₅₅₈), в результате восстанавления НТС супероксидными радикалами. За единицу СОД активности или O^-₂-продуцирующей активности принимали количество белка, которое подавляет или стимулирует образование формазана  на 50%. 

Метгемоглобин (метНb)-восстанавливающую активность изоформ цит b₅₅₈  определяли используя ферри Нb цитоплазмы эритроцитов крыс с величиной плотности оптического поглощения (при 565 нм) 0,8. При этом величина плотности бета-поглощения изоформ цит b₅₅₈ в реакционной смеси составляла 0,03. Непосредственно в кварцевых кюветах спектрофотометра к 3 мл раствору ферри Нb добавляли 0,2 мл суммарной фракции цит b₅₅₈ с А₅₃₀ = 0,4. После перемешивания реакционной смеси ее инкубировали в аэробных условиях в течение 15-16 ч при 30^о. Далее, после повторного перемешивания реакционной смеси, определяли кинетику восстановления ферри Hb до ферро Hb путем измерения снижения плотности альфа-полосы поглощения ферри Hb (это снижение прямо пропорционально образовавшемуся ферро Hb, который имеет максимальное поглощение при 555 нм). Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим титрованием раствора перекиси водорода в присутствии и отсутствии каталазы. За единицу каталазной активности принимали количество фракции, которое расщепляет 0,1 М перекись водорода в течение 1 мин при 20^о. 

Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометре “Specord UV-VIS” c длиной оптического пути 1 см. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли известным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера с определением критерия достоверности Р.

Результаты и обсуждение

Инкубирование ЦФ с гомогенатами тканей и с кровью вызывает неадекватные изменения суммарного уровня МПА – изоформ цит b₅₅₈, полученных из  МК  этих тканей. На фоне увеличения уровня суммарной фракции цит b₅₅₈ МК эритроцитов, печени и мозга, в костном мозгу и в сыворотке крови уровень этих гемопротеинов практически не изменяется (табл.1) и заметно снижается в МК селезенки, сердца  и почек. При этом наблюдается снижение уровня другого МПА – супрола в сыворотке крови. Эти данные свидетельствуют о том, что при аэробном инкубировании ЦФ с гомогенатами тканей, последние оказывают неадекватную резистентность против ЦФ. Уровень же другого МПА –цит С в тканях в подавляющем большинстве снижается под влиянием ЦФ ex vivo, только в почечной ткани наблюдается повышение уровня этого гемопротеина.

В приведенных условиях ЦФ вызывает повышение O^-₂-продуцирующей активности суммарной фракции цит b₅₅₈  из МК печени, мозга, селезенки и почек, но почти не изменяет эту активность у суммарной фракции цит b₅₅₈  из МК костного мозга и сердца (табл. 1).Фактически под влиянием ЦФ не всегда снижение уровня изоформ цит b₅₅₈ в МК тканей ассоциируется с адекватным снижением NADPH-зависимой O^-₂-продуцирующей  активности этих гемопротеинов ex vivo.

Таблица 1

Относительные изменения (%) уровня  NADPH-зависимой -продуцирующей и метHb-восстанавливающей активности суммарной фракции изоформ цит b558  из ЭМ и МК тканей после 48 ч инкубирования крови и гомогенатов тканей крыс с 10 мг/мл циклофосфамидом  ex vivo, по сравнению с 100% контрольными показателями (показатели в отсутствие ЦФ), P ‹ 0,05, n=4

МетHb-восстанавливающая активность суммарной фракции изоформ цит b₅₅₈  ЭМ  и МК других тканей также изменяется неадекватным образом. Повышение этой активности у изоформ цит b₅₅₈ из  МК печени, сердца и мозга сопровождается снижением этой активности у изоформ цит b₅₅₈  из селезенки, ЭМ, мозга и почек (табл. 1). 

Переходя от МПА к МАА, можно констатировать, что под воздействием ЦФ ex vivo активность ключевых МАА (Cu,Zn-СОД, Мn-СОД, каталазы и церулоплазмина) в приведенных биосистемах имеет тенденцию к снижению (только уровень трансферрина повышается), как это показано в табл. 2.

Каковы возможные молекулярно биохимические механизмы непосредственного воздействия ЦФ на гомогенаты тканей и, соответственно, на локализованные в них МАА и МПА ex vivo?

Известно, что цитотоксический эффект и эффект оксидативного повреждения ЦФ in vivo в основном связывается с повышением уровня

Таблица 2

Относительные изменения (%) уровня МАА  из эритроцитов, сыворотки и цитозоля тканей, а также  цит С из цитозоля тканей после 48 ч инкубирования крови и гомогенатов тканей крыс с 10 мг/мл циклофосфамидом  ex vivo, по сравнению с 100% контрольными показателями (показатели в отсутствие ЦФ), Р‹ 0,05, n = 4

перекиси водорода [7,17], в первую очередь с продуктом ее расщепления – гидроксильным радикалом (НО.), при накоплении которых они вызывают денатурирование (инактивирование) изоформ цит b558, а также МАА (Cu,Zn-CОД, церулоплазмин, каталаза) и ДНК, но практически не влияют на трансферрин и Мn-СОД [1, 2, 15]. 

Можно констатировать, что под влиянием ЦФ ex vivo также (как и in vivo) происходит накопление перекиси водорода (гидроксильных радикалов) в гомогенатах тканей в различной степени (это, в первую очередь, зависит от величины каталазной активности в тканях), соответственно, наблюдаются и различного диапазона изменения уровня и активности МАА и МПА, регуляторов метаболизма активных форм кислорода, иммунного ответа, кислородного гомеостаза и генетического кода.

Литература                 

1. Мжельская Т.И. Биологическая функция церулоплазмина. Бюл.эксп.биол.мед., 2000, 130(8), с.124-132. 
2. Симонян Г.М., Симонян Р.М., Симонян М.А. Высокая резистентность сывороточных цитохромов b558 против перекиси водорода по сравнению с другими гемопротеинами. В кн.: Актуальные вопросы военной медицины, ЕрГМУ им.М. Гераци, Ереван, 1999, с. 48-51.
3. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Способ получения металлопротеинов. Лицензия изобр. N908 Армпатента, Ереван, 1997.
4. Симонян М.А., Симонян Г.М., Симонян Р.М. Способ получения цитохромов b из мембран эритроцитов. Лицензия изобр. N 908 Армпатента, Ереван, 2001.
5. Симонян Р.М., Симонян Г.М., Симонян М.А., Бабаян М.А. Х-облучение  эритроцитарных мембран и цитохрома b558 III in vitro стимулирует агрегацию последнего и снижает его O–2 -продуцирующую и метгемоглобин-восстанавливающую активность. Мед.наука Армении НАН  РА, 2004, т. XLIV, 1, с.43-46.
6. Тадевосян Л.Г., Симонян Г.М., Симонян М.А., Геворкян Г.А. Резкое повышение прооксидантного статуса тканей крыс при острой интоксикации циклофосфамидом. Мед.наука Армении НАН  РА,  2007, XLVII, 4, с.34-38. 
7. Abraham P., Sugumar E. Enhanced PON 1 activity in the kidneys of cyclophosphamide treated rats may play a protective role as an antioxidant against cyclophosphamide induced oxidative stress. Arch.Toxicol., 2007.
8. Escobar J.A., Rubio M.A., Lissi E.A. SOD and catalase inactivation by singlet oxygen and peroxyl redicals.  Free Radic.Biol.Med., 1996, 20(3), p. 285-290. 
9. Fridovich I. Superoxide radical and SODs. Ann. Rev.Biochem., 1995, 64, p. 97-112. 
10. Kapr J.D., Szczytkowski J.L. Cyclophosphamide induces dose- and time dependent elevation in spleen norepinephrine levels of BALB/c mice. Neurosci.Lett., 2003, 344(2), p. 117-121.
11. Kondratyeva T.K., Fontalin L.N., Mikheeva N.V. T-cell cell immunodeficiency induced by T-cell mitogens combined with cyclophosphamide injection. Immunol.Lett., 1992, 34(1), p.71-77. 
12. Leonteva T.I., Gladkova N.E., Uteshev B.S. Immunotropic activity of cyclophosphane. Farmacol.Toxocol., 1988, 51(6), p. 60-65. 
13. Potapovich M.V., Eremin A.N., Metelitsa D.I.  Kinetics of  catalase inactivation, induced by ultrasonic cavitation. Prokl.Biochim.Microbiol., 2003, 39(2), p. 161-165.
14. Selvakumar E., Prehalathan C., Mythily Y., Varalakshmi P.  Benifical effects of DL-alpha-lipoic acid on cyclophosphamide-induced oxidative stress in mitochondrial fractions of rat testis. Chem.Biol.Interact., 2005, 152(1), p. 59-66.
15. Suqiura Y., Suzuki T., Kuwahara J., Tanaka H. On the mechanism of H2O2, O2- and ultraviolet light induced DNA clevsges of inactive bleomicin-iron (III) complex. Biochem.Biophys.Res.Communs., 1982, 105(4), p.1511-1520. 
16. Tsai-turton M., Luong B.T., Tan Y., Luderer U.  Cyclophosphamide induced apoptosis in COV434 human granulose cells involves oxidative stress and glutathione depletion.Toxicol.Sci., 2007, 98(1), p.216-230.
17. Zhang G.H., Wu C.F., Duan L., Yang J.Y.  Protective effect of total saponins from stem and leaf of Panaxginseng against cytophosphamide-induced genotoxicity and apoptosis in mouse bone marrow cells and peripheral lymphocyte cells. Food Chem. Toxicol., 2007.
18. Zhang G.H., Wu C.F., Duan L., Yang I.Y. Protective effect of ginsenoside Rg(3) against cyclophosphamide induced DNA damage and cell apoptosis in mice. Arch.Toxicol., 2007.

Вопросы, ответы, комментарии