Региональное влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на нитрергическую систему мозга (Теоретическая и профилактическая медицина)

Ключевые слова: He-Ne лазер, аргинин, мозг, синтаза оксида азота, цитруллин

Низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) способствует улучшению микроциркуляции, нейропротекции, антипатогенной защиты и успешно применяется  во всех областях  медицинской практики– кардиологии, неврологии, психоэндокринологии  и т.д. [5, 14].  Накоплены данные, свидетельствующие, что ферментативная система синтеза универсального биомедиатора, оксида азота (NO), опосредует терапевтические эффекты НИЛИ [1, 19]. В органах и тканях функционируют разные изоформы NO синтазы (NOS), из них наиболее изучены и известны: Са2⁺-кальмодулин (СаМ)-зависимые “конститутивные” NOS (сNOS) (нейрональная и эндотелиальная, nNOS и еNOS, соответственно), участвующие в регуляции центральной и вегетативной нервной систем, а также сердечно-сосудистой, дыхательной, и прочих систем организма, и Са²⁺-СаМ-независимая “индуцибельная” NOS (iNOS), эффектор иммунного и воспалительного ответа, осуществляющая антипатогенную и противоопухолевую защиту [10, 11]. Отличия в регуляции и функциях изоформ NOS проявляются при их вовлечении в патогенез широкого спектра заболеваний, включая инфекционные, онкологические, нейродегенеративные, психические, аутоиммунные и т.д., что может быть использовано для избирательной фармакокоррекции в практической медицине [15, 24]. Однако, как выяснилось, подобные препараты часто оказывают побочные нежелательные эффекты, исключающие их внедрение в клиническую практику [26]. Так, мультицентровое исследование (117 центров из 26 стран; 1997-1998 гг) влияния неселективного ингибитора NOS, 546С88 (N^G-монометил-L-аргинина, L-NMMA) показало повышенную смертность пациентов с септическим шоком, получавших L-NMMA (309 из 522 больных), по сравнению с группой, получавшей плацебо, в связи с чем было принято решение о нежелательности дальнейшей разработки данного препарата [22]. Поиск новых нефарамакологических способов воздействия на изоферменты NOS, включая электромагнитное излучение, является одним из подходов к решению проблемы, и в этом направлении уже ведутся исследования. Недавно было показано, что НИЛИ оказывает ингибирующее воздействие разной степени на активность различных изоферментов NOS в коре головного мозга крыс при экспериментальном инсульте [18]. В представленной работе изучено влияние облучения He-Ne лазером на активность изоформ NOS и уровень метаболитов NO синтазной реакции в разных регионах мозга крыс.

Материал и методы

Эксперименты проводили на беспородных молодых самцах белых крыс массой 100-150г, содержащихся в виварии в естественных условиях освещения и свободного доступа к воде и пище. Животные были разделены на контрольную и опытные группы (n=5/группу) в зависимости от параметров облучения He-Ne лазером. 

Процедура облучения. Одноразовое облучение проводили гелий-неоновым лазером ЛГН-111(λ=632,86 нм). Тело животного фиксировалось и в область экспонируемого участка (спина) направлялся пучок излучения со средней мощностью 1,5 мВт, диаметром – 0,03 см и 1,3 см, разной энергией – 135 мДж и 900 мДж, в зависимости от длительности экспозиции (1,5 и 10 мин). В качестве контроля служили необлученные животные, содержавшиеся в тех же условиях.

Выделение структур мозга. Через 24 ч после облучения животных декапитировали, извлекали мозг и на льду выделяли кору больших полушарий, гиппокамп, полосатое тело  (стриатум) и гипоталамус. Структуры мозга гомогенизировали в течение 2 мин в 10 объемах 20 мМ HEPES буфера (рН–7,4), содержащего 2мМ дитиотреитол и 3 мМ MgCl₂. 6H₂O. В гомогенатах определяли активность изоформ NOS и содержание субстрата и продуктов реакции NOS. 

Определение активности изоформ NOS. Активность NOS определяли по продукции активных форм азота (АФА) при долговременной инкубации (20 ч, 37^оС) гомогенатов исследуемых структур мозга в 20 мМ HEPES буфере pH 7,4, содержащем 2мМ дитиотреитол, 3 мМ MgCl₂. 6H₂O. В инкубационную смесь, в зависимости от условий опыта, вводили 1,15 мМ EDTA или 1,73 мМ CaCl2. Общая активность NOS определялась при инкубации проб в присутствии 1,73 мМ CaCl2, активность iNOS – в присутствии 1,15 мМ EDTA; активность сNOS вычислялась по разности активностей общей NOS и iNOS. Концентрацию белка оценивали по методу Лоури [20]. Активность NOS выражали в нмоль (NО₂^–) . мг^-1 белка . 20 ч^-1. 

Определение активных форм азота. Содержание АФА, то есть NO и его стабильных интермедиатов, окислов азота (NO₂^–, NO₃^–, N₂O₄, N₂O₃), нитрозотиолов, нитрозаминов, определяли на основе неспецифической реакции диазотирования с использованием реактива Грисса-Илосвая в супернатантах депротеинизированных проб (осаждение белков осуществляли 0,5N NaOH и 10% ZnSO₄) спектрофотометрически при длине волны  546 нм [27]. 

Определение L-аргинина и L-цитруллина. Содержание L-аргинина определяли методом [9] и L-цитруллина, используя набор Био-Ла-тест (La Chema, Чехия). 

Статистическая обработка результатов. Достоверность различий средних значений параметров и корреляций (коэффициент линейной корреляции по Пирсону, r) по группам оценивали по t-критерию Стьюдента. В качестве критерия достоверности принимали Р‹0,05.

Результаты и обсуждение

Известно, что НИЛИ оказывает терапевтическое воздействие через потенцирование антибактериального, детоксикационного и иммуностимулирующего эффектов, которые проявляются в определенном диапозоне мощности, частоты и экспозиции [2]. При этом местные эффекты НИЛИ являются частью генерализованной ответной реакции на это неионизирующее излучение и подчиняются тем же закономерностям, и доза определяет результат – стимуляцию жизнедеятельности или угнетение биологической системы [3]. Изучение зависимости биологического действия НИЛИ от параметров излучения также важно для правильной интерпретации экспериментальных результатов [21]. Исходя из вышеизложенного, активность различных изоформ NOS в регионах мозга крыс исследовали при варьировании энергии и интенсивности (разный диаметр пучка) гелий-неонового лазерного излучения (рис. 1). Изучение картины распределения активности изоформ NOS в структурах мозга осуществляли на основе методики долговременного инкубирования гомогенатов. При этом у контрольных крыс наряду с сNOS детектировалась конститутивно функционирующая iNOS, что совпадает с последними сообщениями других авторов  [13, 32]. Ведущая роль в продукции NO отводится iNOS астроцитам – их число в 10-100 раз превосходит, в зависимости от области мозга, количество нейронов, которые воздействуют на нейрональную сеть, участвуя в сложной поведенческой реакции на стресс [13, 17]. Следует отметить, что iNOS в отличие от сNOS способна продуцировать NO довольно длительное время (несколько суток), поэтому она существенно влияет на аккумуляцию NO, который, запуская экспрессию цитопротекторов, гемоксигеназы-1 и белка теплового шока HSP70, повышает резистентность клеток, в том числе в разных регионах мозга [28, 29]. Так, нейроны, содержащие NO-синтазу, проявляют устойчивость к разнообразным патологическим воздействиям [8]. В свете современных представлений, NO-ергическая система является наследственным адаптогенным стресс-лимитирующим фактором, и депонирование NO – это мощный протекторный механизм от стресса и стресс-индуцированных болезней [7].  

Рис. 1.  Влияние энергии и диаметра  пучка гелий-неонового лазерного излучения   на активность изоформ NOS в структурах мозга. 1 – контроль; 

2 – 135 мДж/0,03 см; 3 – 900 мДж/0,03 см; 4 – 135 мДж/1,3 см; 5 – 900 мДж/1,3 см

У контрольных животных распределение активности iNOS было следующим: гиппокамп – 7,08 стриатум – 3,56, гипоталамус – 2,45 и кора – 1,76 нмоль (NO₂^–) . мг^–1 белка . 20 ч^–1. В то же время активность сNOS доминировала во всех структурах и убывала по ряду стриатум › гиппокамп › кора › гипоталамус, составляя 23,38; 11,75; 10,07 и 8,28 нмоль (NO₂^– ) . мг^–1 белка . 20 ч^–1 соответственно. Базальный уровень NO и его стабильных интермедиатов (АФА) в гомогенатах структур мозга положительно коррелировал с активностью iNOS, и cNOS (r= 0,9265; 0,8606 соответственно, р‹ 0,001). Высокая активность исследуемых изоформ NOS и содержание АФА обнаруживались в стриатуме и гиппокампе, где система NOS/NO, участвуя в длительной синаптической потенциации, обеспечивает пластичность межнейронных связей, лежащих в основе обучения и памяти [23]. В стриатуме нитрергическая система принимает участие в контроле моторных функций, координации движений, а в гипоталамусе – в регуляции эмоционального поведения (страх, агрессия): nNOS-делетированные мыши агрессивны и чрезмерно сексуальны [цит. по 6]. 

При параметрах облучения 135 мДж/0,03см (энергия/диаметр пучка) в коре, стриатуме и гиппокампе активность cNOS подавлялась с одновременным повышением в гипоталамусе, в то же время активность iNOS возрастала в коре, стриатуме и гипоталамусе, с небольшим снижением в гиппокампе. Повышение энергии (900мДж/0,03см) или снижение интенсивности (135мДж/1,3см) облучения подавляло iNOS во всех изучаемых структурах и снижало активность cNOS в гиппокампе и гипоталамусе, но уменьшало ее снижение в коре и стриатуме. При 900 мДж/1,3см во всех исследуемых структурах мозга полностью подавлялась активность iNOS и повышалась сNOS.  Таким образом, в зависимости от энергии и интенсивности гелий-неонового лазерного излучения, в структурах мозга при подавлении кальцийзависимой активности NOS наблюдалось повышение кальцийнезависимой активности NOS и наоборот, что свидетельствует о наличии взаиморегулируемых механизмов эндогенной генерации NO в этих регионах головного мозга и открывает новые возможности лазерной терапии в целях избирательного воздействия на изоформы NOS. Это приобретает особое значение, поскольку нарушения в функционировании нитрергической системы, когда компенсаторные функции NO перекрываются дезадаптивными, часто связываются со сверхэкспрессией в мозге iNOS и гиперпродукцией NO, участвующих в развитии таких нейродегенеративных заболеваний, как болезни Альцгеймера, Паркинсона, Гантингтона и  пр. [15, 16, 25, 30].

При облучении He-Ne лазером изменялось содержание субстрата реакции NOS аргинина и продуктов, АФА и цитруллина (рис. 2). При этом уровни АФА и цитруллина, коррелировали в  коре, стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе (r = 0,6346; 0,8487; 0,5027; 0,3779  соответственно, р ‹ 0,001), подтверждая вклад метаболического пути аргинин NO в пул этих соединений. В то же время в гиппокампе и особенно в гипоталамусе коэффициент корреляции был ниже. По-видимому, в этих регионах при облучении повышается активность ферментов цикла цитруллин NO: аргининосукцинат синтазы и аргининсукцинатлиазы, которые обеспечивают синтез аргинина из цитруллина и автономное снабжение субстратом NOS, и представлены практически во всех органах, мозге в том числе  [31]. Корреляция между уровнем АФА и  аргинином в коре, стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе  (r = 0,7746; 0,9471; 0,3222; 0,7751  соответственно,  р ‹0,001) указывает на вероятность такого сценария в гипоталамусе, но не в гиппокампе, в котором, по-видимому, под влиянием НИЛИ активируются другие пути метаболизирования аргинина, что еще предстоит выяснить.

Рис. 2.  Дозозависимое влияние гелий-неонового лазерного облучения на содержание метаболитов реакции NOS в разных регионах мозга. 1 – контроль; 2 – 135 мДж/0,03 см; 3 – 900 мДж/0,03 см; 4 – 135 мДж/1,3 см; 

5 – 900 мДж/1,3 см

Следует отметить, что при определенных параметрах облучения, несмотря на снижение общей активности NOS в структурах мозга, возрастание энергии излучения и/или снижение его интенсивности  сопровождалось повышением уровня АФА в них. Подобное явление скорее всего связано со стимулированием активности супероксиддисмутазы (СОД) применяемыми дозами гелий-неонового лазерного облучения, как это было продемонстрировано на макрофагах крыс [4]. Снижение ферментом содержания супероксид радикала, активно взаимодействующего с NO, будет повышать уровень последнего и его стабильных интермедиатов [12], неадекватно отражая изменения в активности NOS, в отличие от цитруллина.

Таким образом, нами получены данные о региональных различиях во влиянии гелий-неонового лазерного облучения на кальцийрегулируемую и кальцийнезависимую ферментативные системы генерации NO мозга крыс и возможности селективного воздействия на них в зависимости от энергии и интенсивности излучения. Полученные результаты указывают на новые возможности, открывающиеся перед низкоинтенсивной лазерной терапией, а также на необходимость учитывать влияние разных параметров НИЛИ на изоформы NOS на экспериментальных моделях животных.  

Литература

1. Владимиров Ю.А., Клебанов Г.И., Борисенко Г.Г., Осипов А.Н. Молекулярно-клеточные механизмы влияния низкоинтенсивного лазерного излучения. Биофизика, 2004, т. 49, 2, с. 339-350.
2. Камалян Н.С. Биофизические основы механизма действия низкоинтенсивного лазерного излучения. Вестник МАНЭБ, 2002, т. 7,  6 (54), с. 64-69.
3. Кару Т.Й. Клеточные механизмы низкоинтенсивной лазерной терапии. Лазер и здоровье – 99. Материалы меж. конгр., М., 1999, с. 447-448.
4. Клебанов Г.И., Полтанов Е.А., Чичук Т.В., Осипов А.Н., Владимиров Ю.А. Изменение активности супероксиддисмутазы и содержания пероксинитрита в перитонеальных макрофагах подвергнутых облучению He-Ne лазером. Биохимия, 2005, т. 70, 12, с. 1623–1630.
5. Москвитин С.В., Буйлин В.А. Низкоинтенсивная лазерная терапия. М.,  2000.
6. Недоспасов А.А. Биогенный NO в конкурентных отношениях. Биохимия, 1998, т. 63, 7, с. 881–904.
7. Пшенникова М.Г. Врожденная эффективность стресс-лимитирующих систем, как фактора резистентности к стресс-индуцированным болезням . Усп. физиол. наук, 2003, т. 34, 3, с. 55–67.
8. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник. Сорос. образ. журн.,  2000. 10, c. 105–110.
9. Akamatsy S., Watanabe T.J.  Arginine determination in tissues. J. Biochem., 1961, v. 77, p. 484–486.
10. Alderton W.K., Cooper C.E., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition.  Biochem. J., 2001, v. 357,  3, p. 593–615.
11. Bredt D.S. Endogenous nitric oxide synthesis: biological functions and pathophysiology.  Free Radic. Res., 1999, v. 31, 6, p. 577-596.
12. Bruckdorfer R. The basics about nitric oxide. Mol. Aspects Med., 2005, v. 26, p. 3–31.
13. Buskila Y., Abu-Ghanem Y., Levi Y., Moran A., Grauer E., Amitai Y. Enhanced astrocytic nitric oxide production and neuronal modification in the neocortex of a NOS2 mutant mouse. PLoS one, 2007, v. 2,  9, p. 843-855.
14. Dougherty T.J., Comer C.J., Henderson B.W. Photodynamic therapy. J. Nation. Cancer Inst., 1998, v. 90, p. 889–905.
15. Esh T., Stefano G.B., Fricchione G.L., Benson H. Stress-related diseases – a potential role for nitric oxide. Med. Sci. Monit., 2002, v. 8,  6, p. 103–118.
16. Farrer M.J. Genetics of Parkinson disease: paradigm shifts and future prospects. Nat. Rev. Genet., 2006, v. 7, p. 306–318.
17. Gensert J.M., Ratan R.R. The metabolic coupling of arginine metabolism to nitric oxide generation by astrocytes. Axntioxid. Redox. Signal., 2006, v. 8, 5-6, p. 919-928.
18. Leung M.C., Lo S.C., Siu F.K., So K.F. Treatment of experimentally induced transient cerebral ischemia with low energy laser inhibits nitric oxide synthase activity and up-regulates the expression of transforming growth factor-beta 1. Lasers Surg. Med., 2002, v. 31, 4, p. 283–288.
19. Lindgard A., Hulten L.M., Svensson L., Soussi B. Irradiation at 634 nm releases nitric oxide from human monocytes. Lasers Med. Sci., 2007, v. 22, 1, p. 30-36.
20. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265–275. 
21. Nicola J.H., Nicola E.M. Wavelength, frequency, and color: absolute or relative concepts? J. Clin. Laser Med. Surg., 2002, v. 20, No 6, p. 307– 311.
22. SCRIP, 1998, 2330, p. 21.
23. Shimuzu E., Tang Y.P., Rampon C., Tsien J.Z. NMDA receptor-dependent synaptic reinforcement as a crucial process for memory consolidation. Science, 2000, v. 290, 5494, p. 1170-1174.
24. Southan G.J., Szabo C. Selective pharmacological inhibition of distinct nitric oxide synthase isoforms. Biochem. Pharmacol., 1996, v. 51, 4, p. 383–394.
25. Tabner B.J., Turnbull S., El-Agnaf O., Allsop D. Production of reactive oxygen species from aggregating proteins implicated in Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and other neurodegenerative diseases. Curr. Top. Med. Chem., 2001, v. 1, p. 507-517.
26. Thiemerman C. Nitric oxide and circulatory shock: an update. In: Nitric oxide. /Gryglewski R.J., Minuz P., Ed./; IOS Press:  Amsterdam, 2001, v. 317, p. 117-125.   
27. Tracey W.R., Linden J., Peach M.J., Johns R.A. Comparison of spectrophotometric and biological assays for nitric oxide and endothelium-derived relaxing factor: non-specificity of the diazotization reaction for NO and failure to detect EDRF. J. Farm. Exp. Ther., 1989, v. 252,  3, p. 922–928.
28. Vina J., Borras C., Gomez-Cabrera M.C., Orr W.C. Part of the series: from dietary antioxidants to regulators in cellular signaling and gene expression. Role of reactive oxygen species and (phyto)oestrogens in the modulation of adaptive response to stress. Free Radic. Res., 2006, v. 40, p. 111-119.
29. Vodovoz Y., Kwon N.S., Pospichil M., Manning J., Paik J., Nathan C. Inducible nitric oxide synthase. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J. Immunol., 1994, v. 152, p. 4110-4118. 
30. Wallace M. N., Geddes J. G., Farquhar D. A., Masson M. R. Nitric oxide synthase in reactive astrocytes adjacent to beta-amyloid plaques. Exp. Neurol., 1997, v. 144, p. 266-272. 
31. Wu G., Morris S.M. Arginine metabolism: nitric oxide and beyond. Biochem. J., 1998, v. 336, p. 1-17.
32. Zarazua S., Perez-Severiano F., Delgado J.M., Martinez L.M. Decreased nitric oxide production in the rat brain after chronic arsenic exposure. Neurochem. Res., 2006, v. 31, 8, p. 1069-1078.

Вопросы, ответы, комментарии