Med-Practic
Посвящается выдающемуся педагогу Григору Шагяну

События

Анонс

У нас в гостях

Aктуальная тема

Вопросы теоретической и клинической медицины 2.2010

Повышение NADPH-зависимой супероксид- продуцирующей и ферринъ- восстанаваивающей активностей изоформы цитохрома b558 КИСЛОГО Характера из клеток опухолевой ткани саркомы -37 мышей под влиянием богатого пролином полипептида (бпп-1) in vitro

Иммуногистохимическим методом выявлена экспрессия цит b558 в лимфоидной опухолевой ткани, используя два специальных антигена для цитохрома b558, а цит b558 представляется как новый агент для дифференциации лимфоцитов. Этим путем обнаружено присутствие цит b558 в опухолевой ткани [1]. В другой работе, методом RT-PCR определена экспрессия гена цит b558 (NOX 1-5) в культуре опухолевых клеток человека, а также опухолевой ткани и здоровой ткани. Указывается роль NOX (NADPH оксида- за), как потенциального фактора развития и проли-ферации опухолевых клеток [2]. Причем цАМФ стимулирует экспрессию NADPH оксидазы (5-ти NOX) клеток аденокарциномы пищевода, а NOX-5 существенно снижает фосфолирование белка ретинобла- стомы и повышает апоптоз клеток и экспрессию каспоз-9 [3]. При этом, внеклеточные матрицы стимулируют продуцирование O2¯ NADPH оксидазой (NOX-4) опухолевых клеток поджелудочной железы человека, повышая выживаемость этих клеток [4]. Эти 5 изоформ цит b558 иницируют ферментативный перенос электрона от NADPH к молекулярному кислороду, NADPH оксидазным механизмом [5]. Эти гемопротеины играют ключевую роль регуляции генома, митохондриального дыхания, иммунной системы [6-8], а также кислородного гомеостаза [9]. Поэтому, важно изучить состояние (уровень, активность, оптико-спектральные особенности) цит b558 выделенных из клеток опухолевой ткани, в частности из клеток ткани саркомы-37 у мышей, а также из клеток других тканей (селезенка, печень, эритроциты) мышей в отсутствии юпухоли, сравнивая их NADPH зависимой O2¯ -продуцирующей и ферригемоглобин (ферриНb) востанавливающей активности в отсутствии и присутствии богатого пролином полипептида (БПП-1), который имеет антиопухолевое и анти- стрессорное действие [10,11].

 

Целью работы являлось, использованием ранее разработанного метода [13], впервые получить фракции изоформ кислого характера цит b558 не только из клеток тканей здоровых мышей (селезенка, печень, эритроцитарные мембраны), но и непосредственно из опухолевой ткани саркомы-37 мышей и сравнить уровни, NADPH зависимой O2- -продуцирующей и ферриНb-востанавливающей активности этих фракций изоформ цит b558 в отсутствии и под влиянием БПП-1 in vitro.

 

Материал и методы

 

Саркома-37 (С-37) получена от прививаемой опухоли-карциномы молочной железы мышей и по гистологическому строению С-37 является недифференцированной опухолью [12]. Прививается в 100% случаев. Опухоль формируется в течение 3-5 дней после прививки (латентный период). Для прививки в качестве трасплантанта служила 12-14 дневная опухолевая ткань карциномы молочной железы мышей [12]. Кусочек опухолевой ткани (18-22г), в стерильных условиях, очищается от некротических участков, приготавливается гомогенная масса микрораз- мельчителем ткани, в физрастворе (1:5об/об). По-лученный гомогенат вводится мышам подкожно, в объеме 0.3мл. Декапитирование животных (белые мыши) опытной группы (с С-37) и контрольной группы (по 6 животных) осуществляли на седьмой день опыта.

 

Получение фракции изоформ цит b558 из опухолевой ткани С-37 мышей. Опухоль С-37 подкожной локализации отделяли у опытных мышей, очищали от жирных и других остатков, промывали физраствором и взвешивали (по 7г). Гомогенизацию опухолевой ткани осуществляли размельчителем тканей с угловой скоростью вращения ножей 500об/мин. в дистиллированной воде (1:10об/об) при 4о, в течение 4мин. Выделение фракции изоформ цит b558 из опухо-левой ткани С-37 осуществляли разработанным ранее методом [13], с небольшим видоизменением (оно связано с увеличением продолжительности гомео- генизации опухолевой ткани). Осадок собирали путем центрифугирования гомогената в течение 20мин (при 10000об/мин). После повторной гомогенизации осадка в воде и центрифугирования в аналогичных условиях из осадка осуществляли процесс солюбилизации фракции изоформ цит b558. После диализа этой смеси против воды и центрифугирования при 13000об/мин, в течение 20мин, надосадочный раствор подвергали ионобменной хромотаграфии сперва на колонке с целлюлозной КМ-52 (для удаления гемоглобина и других сопутствующих белков основного характера). Не осевшийся на колонке с КМ-52 фракцию далее подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозе ДЕ-52 (также уравновешенную 0,002 М калий фосфатным буфером, pH 7,4 (КФБ)). Фракцию цит Ь558 кислого характера из последней колонки элюировали 0,2 М КФБ-ом.

 

Получение фракции изоформ цит b55S кислого характера из эритроцитарных мембран мышей. Процедуру получения этих гемопротеинов осуществляли также универсальным методом, с использованием ионообменной хроматографии [13]. Из крови мышей (по 1.5мл) эритроциты осаждали добавлением к этой крови физраствора (1:20 мл). После центрифугирования осажденных эритроцитов при pH 5,6 (при 6000 об/мин, 5мин) их подвергали гемолизу в воде (1:10об/об). Эритроцитарные мембраны (ЭМ) осаждали центрифугированием гемолизата при 10000об/ мин, в течение 15мин. Далее, осажденные ЭМ повторно смешивали с водой (1:200об/об) и после центрифугирования в аналогичных условиях осажденные ЭМ смешивали с водой (1:10) и осуществляли процесс солюбилизации суммарной фракции изоформ цит b558 ЭМ. После диализа против воды и центрифугирования смеси, из надосадочного раствора фракцию цит b558 кислого характера получали также ионообменным хроматографированием, сперва на колонках с КМ-52 и затем на ДЕ-52, как это показано на примере получения цит b558 из клеток ткани С-37.

 

Получение фракции изоформ цит b558 кислого характера из клеток ткани селезенки и печени белых мышей. Процедуру получения этой фракции также осуществляли методом [13], сиспользованием ионообменной хроматографии белковых фракций из селезенки (по 0,25г) и печени (по 4,4 г). Разница состоит лишь в том, что гомогенизацию тканей осуществляли стеклянным гомогенизатором с тефлоновым пестиком, со скоростью вращения 500об/мин, при 4о. Как и прежде из колонки с ДЕ-52, элюлирова- ние фракции цит b558 кислого характера из клеток селезенки и печени, осуществляли 0,2М КФБ. Супероксид (О2- )-продуцирующую активность фракции изоформ цит b558 кислого характера определяли нитротетрозолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента стимулирования образования формазо- на (при 560нм) в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу О2- -продуцирующей активности принимали количество белка, которое стимулирует образование формазана на 50%. При этом NADPH зависимую О2- -продуцирующую активность цит b558 определяли заранее инкубировав этот гемопротеин с NADPNa4 (10-4М) в течение 20мин при 4о. В этой реакционной смеси (3мл) величина плотности поглощения (при 530нм) цит b558 составляла 0,03. Ферригемоглобин (ферриHb)- восстанавливающую активность изоформ цит b558 определяли следующим путем, имея в основании то явление, что при аэробном инкубировании цит b558 и ферриHb, происходит восстановление ферриHb до феррoHb in vitro [9]. В частности, был использован электрофоретически гомогенный ферриHb из эритроцитов крыс. К 3мл этого ферриHb (с А565=0.9) добавляли цит b558 из различных источников (эритроциты, селезенка, печень и опухоль С-37 мышей) объемом 0,1мл и с Ао530=0,3 (плотность оптического поглощения β-полосы на оптическом спектре матричного раствора изоформ цит b558). В опытах определения влияния БПП-1 заранее инкубировали цит b558 и БПП-1 в течение 15-20мин при 20о (так поступали и при определении влияния БПП-1 на NADPH зависимой 02- -продуцирующей активности цит b558), а потом дабавляли ферриНЬ и без перемешивания ставили реакционную смесь при 36о в течение 5-6ч. Далее, реакционные смеси поместили в стеклянных трубках (5х1см) и регистрировали кинетику снижения изменения плотности а-поглощения (при 565нм) ферриНb, инкубировав реакционную смесь в течение 4-хч, при 20о. Постепенное восстановление ферриНЬ до ферроНb сопровождается снижением плотности а-поглощения ферриНb. Это снижение прямо пропорционально образованию ферроНb (при 555нм). За единицу ферриНЬ-восстанавливающей активности принимается количество цит b558, вызывающего снижение плотности а-поглощения ферриНb до 0,05 в течение 30мин, при 20о. Синтетический аналог богатого пролином полипептида из нейросекреторных гранул [10] использовали в количестве до 4мкг. Оптические спектры поглощения были регистрированы на спектрофотометре „Specord UV/VIS″ (Германия) с длиной оптического пробега 1см. В ходе работ были использованы центрифуги К-70 и К-24 (Германия).

 

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера, с определением критерия достоверности „Р".

 

Результаты и обсуждение

 

Впервые, по ранее разработанному методу [13], получены фракции изоформ цит b558 из клеток опухолевой ткани саркомы-37 (С-37) мышей, а также из клеток селезенки, печени и эритроцитарных мембран здоровых мышей. В отличие от других методов, получение этих гемопротеинов, настоящим, сравнительно простым методом фракции изоформ цит b558 из приведенных тканей получается в течение всего 5-6ч.с выходом 65-68%. Удельное содержание фракций изоформ цит b558 (в расчете на 1мл фракции и 1г ткани или 1 мл эритроцитов) -плотность оптического поглощении β-полосы (А530 нм) таковы:

 

0.45 ± 0.03 (для цитb558 из клеток С-37);

8,10 ± 0,5 (для цит b558 из клеток селезенки);

4,12 ± 0.3 (для цит b558 ЭМ);

1,21 ± 0,1 (для цит b558из клеток печени).

 

Эти данные свидетельствуют о том, что по сравнению с клетками других тканей в клетках С-37 содержание изоформ цит b558 несравнительно низкое. Получение цит b558 из клеток С-37, из клеток печени, селезенки и из ЭМ в окисленном и в востановлен- ном состоянии показывают характерные для цит b558  из тканей крыс или крови человека, спектров (рис.1). После восстановления дитионитом натрия появляется характерное для цитb558 поглощение при 558нм. Однако, по величинам оптического спектрального индекса (А412530) фракции изоформ кислого характера цит b558 мышей несколько отличаются. Она для цит b558 из клеток печени составляет 11, из ЭМ-9,8; из клеток селезенки-8,2 и из клеток С-37-11,6. Все полученные фракции изоформ цит b558 из тканей мышей (включая и цит b558 из клеток С-37) являются водорастворимые гемопротеины, и все они обладают как NADPHзависимой О2 - -продуцирующей, так и ферриHb-восстанавливающей активностями (рис 2,3).

 

Рис. 1. Оптические спекторы поглощения фракции изоформ цит b558 кислого характера: а–из клеток печени в окисленном (1) и в восстановленном (2) состоянии, б–из ЭМ в окисленном (1) и в восстановленном состоянии (2),в–то же самое из клеток селезенки, г– то же самое из клеток С-37


 

Рис. 2. NADPH зависимая O -продуцирующая активность фракции изоформ цит b558: из клеток С-37 (1), из клеток селезенки (2), печени (3), из ЭМ (4), из С-37,после 20 минутной инкубации с 4 мкг БПП-1 (5) 

 

Рис. 3. Кинетические кривые снижения плотности α-поглощения ферриHb (при 565 нм) под влиянием фракции кислого характера цит b558 из: а–клеток С-37 (1), печени (2), ЭМ (3), селезенки (4) и после 20 мин инкубирования цит b558 из С-37 с БПП-1 (5), б–скорости снижения α-полосы поглощения цит b558 (tgα наклона угла кинетических кривых) под влиянием фракции изоформ цит b558: из селезенки (1), ЭМ (2), печени (3), из клеток С-37 (4), цит b558 из клеток С-37, с 20 мин. инкубированием с 4 мкг БПП-1 (5)

 

Высокой МАБРИ зависимой О -продуцирующей активностью обладают фракции цит b558 из клеток С-37, по сравнению с активностью цит b558 из печени, селезонки и ЭМ. Интересно то обстоятельство,что низкие дозы БПП-1 (4мкг) повышают NADPH зависимую O2- -продуцирующую активность изоформ цит b558 из клеток С-37 in vitro (до 16,6 ± 2,1%, Р‹0,05).Возможно, этим путем БПП-1 нарушает окислительно-восстановительный баланс опухолевых клеток, ассоциированного с повышением уровня −O , что в свою очередь может вызывать гибель этих клеток. Этот эффект БПП-1 может играть важную роль для выявления антиопухолевого эффекта БПП-1 [11].

 

По сравнению с другими изоформами цит b558 кислого характера, цит b558 из клеток ткани С-37 обладает низкой ферриHb-восстанавливающей активностью,как это показано на примере снижения плотности максимального оптического поглощения ферриHb с характерной кинетической зависимостью (рис. 3а).Наклон угла этих кинетических кривых (А565/ч)–tgα соответственно выше у цит b558 из клеток селезенки,затем из ЭМ. Цит b558 из клеток С-37 обладают сравнительно низкой ферриHb-восстанавливающей активностью. Инкубировании цит b558 из клеток С-37 с БПП-1 (также до 4мкг) вызывают существенное повышение ферриHb-восстанавливающей активности этого цит b558 (рис. 3 б). Нетрудно заметить, что возможно и этим механизмом БПП-1 проявляет антиопухолевый эффект, вызывая чрезмерное стимулирование кислородного гомеостаза опухолевых клеток.Это может быть объяснено тем обстоятельством, что опухолевые клетки очень чувствительны к нарушениям аэробных метаболических процессов и их выживаемость снижается, как в результате увеличения физиологического уровня − O , так и повышения физиологического уровня антирадикальной защитной системы [11]. Необходимо подчеркнуть, что активность −O-продуцирующих систем в опухолевых клетках превышает активности антиоксидантной системы до 10 раз и любое нарушение баланса между анти- и прооксидантной системы приводит к гибели опухолевых клеток. Фактически, цит b558 из опухолевых клеток С-37 у мышей обладает низкой ферриHb-восстанавливающей активностью, по сравнению с другими изоформами цит b558 из клеток ткани мышей.

 

Таким образом, впервые с использованием простого метода ионообменной хроматографии на целлюлозах КМ-52 и ДЕ-52, получены фракции изоформ цит b558 из клеток опухолевой ткани С-37 мышей, а также из других тканей здоровых мышей, сравнительно в коротких сроках (до 5-8 ч). Эти цит Ь558 по форме и по максимумам оптического поглощения практически не отличаются от показателей цит b558  полученных из других источников. Фракция изоформы цит b558 кислого характера из клеток мышей с C-37 обладает повышенной NADPH зависимой O  -продуцирующей активностью и пониженной ферриНb- восстанавливающей активностью, а БПП-1 (4мкг) увеличивает эти активности in vitro, которые могут считаться как возможные механизмы антиопухолевого действия БПП-1.

 

Работа выполнена при финансовой поддержке программы МНТЦ А-1701.

 

Список литературы 

 

  1. Shiota M; Moris S; Imajoh-Ohmi S; Nakamura M; Kanegasaki S; Serizawa H; Izumo T; Uehara T Pathol. Res. Pract; 1993, 189 (9), 985-991.
  2. Juhasz A; Ge Y; Markel S; Chiu A; Matsumoto L; van Bagooy J; Ray K; Doroshov J.H. Free Radie. Res; 2009, 43 (6), 523-532.
  3. Fu X; Beer D. G; Behar J; Wands J; Lambeth D; Cao W. J. Biol. Chem; 2006, 281 (29), 20368-20382.
  4. Edderkaoui M; Hong P; Vaquero E.C; Leej K; Fisher L; Friess H; Buchler M.W; Lerch M.M; Pandol S.I; Gukovskaya A.S. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol; 2005, 289 (6), G 1137-G-1147.
  5. 5.Jlonen J.K; Rgsgnen J.V; Sihvo E.I; Knuuttila A. et al. Acta Oncol; 2009, 48 (7), 1054-1061.
  6. Vignais P.V. Cell. Mol. Life Sci., 2002, 59 (9), 1428-1459.
  7. Taille C. El-Benna J. et al. J. Biol. Chem., 2005, 280 (27), 25350-25360.
  8. Ushio-Fukai M. Sci. STKE, 2006, 349, p. re 8.
  9. Simonyan G.M; Simonyan R.M; Simonyan M.A. Electronic J. of Natural Sciences, NAS RA, 2006, 2 (7), 3-6.
  10. Galoyan A.A. Plenum publishers., N.-Y; 2004, 188 p.
  11. Симонян Г.М; Нерсесян А.К; Симонян Р.М; Бабаян М.А; Симонян М.А; Галоян А.А. Нейрохимия, 2005, 22 (2), 125-130.
  12. Пароникян Е.Т; Акопян Ш.Ф; Норавян А.С. и др. Хим. Фарм. Ж., 2009, 43 (2), 17-21.
  13. Симонян Г.М; Симонян Р.М; Симонян М.А. Получение цитохромов b558 из клеточных компонентов. Лицензия изобретения Армпатента А-2233, 2008 г. 
 

Автор. М.К-Алексанян, КА.Галоян, Г.М.Симонян, Г.М.Степанян, Р.М.Симонян, Р.Е.Мурадян, С.С.Алексанян, МА.Симонян, АА.Галоян Гюмрийский Государственный Педагогический Институт им. М. Налбандяна, Гюмри Институт биохимии НАН РА, Ереван НТЦОФХ НАН РА, Ереван Mil
Источник. Вопросы теоретической и клинической медицины 2.2010
Информация. med-practic.com
Авторские права на статью (при отметке другого источника - электронной версии) принадлежат сайту www.med-practic.com
Share |

Вопросы, ответы, комментарии

Читайте также

Антибактериальная активность новозеландского меда мануки и перспективы его клинического применения

Мёд и другие продукты пчеловодства занимают достойное место в традиционной медицине в течение многих столетий. В последние годы возобновился интерес к поиску и исследованию различных видов мёда...

Биометрическое исследование размеров зубов, зубных рядов, апикальных базисов челюстей у пациентов с мезиальной окклюзией

Мезиальная окклюзия является сложным по своей сути видом аномалии зубочелюстной системы, полиэтиологична и имеет в основе своей морфологические, функциональные и эстетические нарушения зубочелюстной системы...

Инвалидность как показатель состояния здоровья населения

Введение

Здоровье, как медико-демографическая и социальная категория, является одним из важных показателей, характеризующих развитие общества. Каждый человек мечтает сохранить здоровье, продлить возраст высокой работоспособности...

Реакция кардиогемодинамических показателей учащихся на экзаменационный стресс

Период школьного обучения, являясь стрессонасыщенным этапом жизнедеятельности, вносит свои коррективы в процесс онтогенетического развития учащихся, главным индикатором которого являются показатели здоровья [9,11,12]...

Изменения морфологических параметров зубочелюстной системы после Ортодонтического лечения мезиальной окклюзии

Большое разнообразие этиологических факторов мезиальной окклюзии, нарушения функций зубочелюстной системы у пациентов с этой патологией, аномалия строения костей лицевого отдела черепа...

Эффективность использования методики автоматизированной регистрации слуховых вызванных потенциалов в проведении неонатального аудиологического скрининга

Введение

В настоящее время вопрос раннего выявления врожденной тугоухости и глухоты, а также своевре-менного проведения реабилитационных мероприятий является важной задачей, затрагивающей не только интересы отечественного здравоохранения, но также социальной и экономической сферы...

Применение методов диагностики при лечении заболевании Пародонта у ортодонтических пациентов

Проблема профилактики, диагностики и лечения стоматологических заболеваний у детей и подростков продолжает оставаться одной из самых актуальных и полностью не разрешенных задач современной медицины Влияние факторов риска возникновения основных стоматологических заболеваний...

Клинико-цитологическая оценка эффективности низкоинтенсивного Лазерного облучения гнойных ран у детей

Около 10 лет в клинике детской хирургии Университетской больницы №1, в комплексном лечении гнойно-септических заболеваний, мы применяем низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), получая значительное улучшение состояния больных, что проявляется укорочением времени выздоровления на 30%...

Результаты анкетирования пациентов, нуждающихся в ортодонтическом лечении

За последнее время в отечественной ортодонтии произошли существенные перемены. Если раньше съемные аппараты применяли в 90% случаев, то сегодня у 84% пациентов проводят лечение с использованием несъемной аппаратуры. В связи с этим, проблема профилактики кариеса зубов и заболеваний пародонта...

Современные подходы к выбору метода лечения скученности зубов

Выбор ортодонтического метода лечения аномалий зубной дуги, проявляющихся тесным положением зубов у детей, подростков и взрослых, всегда представляет определенные трудности...

Удельный вес больных с одонтогенными гайморитами в структуре стационарных стоматологических заболеваний по материалам некоторых клиник Г.Еревана

По данным разных авторов, одонтогенный гайморит (ОГ) составляет от 3 до 7% от общего числа хирургических стоматологических заболеваний [3,16,23,25]. Среди воспалительных заболеваний верхнечелюстной пазухи (ВПЧ) одонтогенный гай-морит составляет от 10 до 40% [3,16,20,26,28]...

Эндотелиальная функция и толщина

Введение. Поражение сонных артерий, как мар-кер повреждения органов-мишеней у больных арте-риальной гипертензией (АГ), влияет главным обра-зом на прогноз заболевания и включёно в систему стратификации риска субъектов с АГ [16]...

Лечебная эффективность системы

В комплексе методов немедикаментозной терапии дискогенной пояснично-крестцовой радикуло- патии важное место занимают методы неинвазивной декомпрессии межпозвонковых дисков [4, 5, 9, 11]...

Уровень качества жизни больного как показатель эффективности комплексной терапии дискогенной пояснично-крестцовой радикулопатии

Методология и критериальные подходы современной доказательной медицины выдвигают вопрос необходимости оценки степени эффективности проведенного лечения на основании т.н. «конечных точек» (endpoint measures)...


Notice: Undefined index: HTTP_X_FORWARDED_FOR in /sites/med-practic.com/classes/flud_class.php on line 33

САМЫЕ ЧИТАЕМЫЕ СТАТЬИ