Повышение NADPH-зависимой супероксид- продуцирующей и ферринъ- восстанаваивающей активностей изоформы цитохрома b558 КИСЛОГО Характера из клеток опухолевой ткани саркомы -37 мышей под влиянием богатого пролином полипептида (бпп-1) in vitro

Иммуногистохимическим методом выявлена экспрессия цит b₅₅₈ в лимфоидной опухолевой ткани, используя два специальных антигена для цитохрома b₅₅₈, а цит b₅₅₈ представляется как новый агент для дифференциации лимфоцитов. Этим путем обнаружено присутствие цит b₅₅₈ в опухолевой ткани [1]. В другой работе, методом RT-PCR определена экспрессия гена цит b₅₅₈ (NOX 1-5) в культуре опухолевых клеток человека, а также опухолевой ткани и здоровой ткани. Указывается роль NOX (NADPH оксида- за), как потенциального фактора развития и проли-ферации опухолевых клеток [2]. Причем цАМФ стимулирует экспрессию NADPH оксидазы (5-ти NOX) клеток аденокарциномы пищевода, а NOX-5 существенно снижает фосфолирование белка ретинобла- стомы и повышает апоптоз клеток и экспрессию каспоз-9 [3]. При этом, внеклеточные матрицы стимулируют продуцирование O₂¯ NADPH оксидазой (NOX-4) опухолевых клеток поджелудочной железы человека, повышая выживаемость этих клеток [4]. Эти 5 изоформ цит b₅₅₈ иницируют ферментативный перенос электрона от NADPH к молекулярному кислороду, NADPH оксидазным механизмом [5]. Эти гемопротеины играют ключевую роль регуляции генома, митохондриального дыхания, иммунной системы [6-8], а также кислородного гомеостаза [9]. Поэтому, важно изучить состояние (уровень, активность, оптико-спектральные особенности) цит b₅₅₈ выделенных из клеток опухолевой ткани, в частности из клеток ткани саркомы-37 у мышей, а также из клеток других тканей (селезенка, печень, эритроциты) мышей в отсутствии юпухоли, сравнивая их NADPH зависимой O₂¯ -продуцирующей и ферригемоглобин (ферриНb) востанавливающей активности в отсутствии и присутствии богатого пролином полипептида (БПП-1), который имеет антиопухолевое и анти- стрессорное действие [10,11].

Целью работы являлось, использованием ранее разработанного метода [13], впервые получить фракции изоформ кислого характера цит b₅₅₈ не только из клеток тканей здоровых мышей (селезенка, печень, эритроцитарные мембраны), но и непосредственно из опухолевой ткани саркомы-37 мышей и сравнить уровни, NADPH зависимой O2^- -продуцирующей и ферриНb-востанавливающей активности этих фракций изоформ цит b₅₅₈ в отсутствии и под влиянием БПП-1 in vitro.

Материал и методы

Саркома-37 (С-37) получена от прививаемой опухоли-карциномы молочной железы мышей и по гистологическому строению С-37 является недифференцированной опухолью [12]. Прививается в 100% случаев. Опухоль формируется в течение 3-5 дней после прививки (латентный период). Для прививки в качестве трасплантанта служила 12-14 дневная опухолевая ткань карциномы молочной железы мышей [12]. Кусочек опухолевой ткани (18-22г), в стерильных условиях, очищается от некротических участков, приготавливается гомогенная масса микрораз- мельчителем ткани, в физрастворе (1:5об/об). По-лученный гомогенат вводится мышам подкожно, в объеме 0.3мл. Декапитирование животных (белые мыши) опытной группы (с С-37) и контрольной группы (по 6 животных) осуществляли на седьмой день опыта.

Получение фракции изоформ цит b₅₅₈ из опухолевой ткани С-37 мышей. Опухоль С-37 подкожной локализации отделяли у опытных мышей, очищали от жирных и других остатков, промывали физраствором и взвешивали (по 7г). Гомогенизацию опухолевой ткани осуществляли размельчителем тканей с угловой скоростью вращения ножей 500об/мин. в дистиллированной воде (1:10об/об) при 4^о, в течение 4мин. Выделение фракции изоформ цит b₅₅₈ из опухо-левой ткани С-37 осуществляли разработанным ранее методом [13], с небольшим видоизменением (оно связано с увеличением продолжительности гомео- генизации опухолевой ткани). Осадок собирали путем центрифугирования гомогената в течение 20мин (при 10000об/мин). После повторной гомогенизации осадка в воде и центрифугирования в аналогичных условиях из осадка осуществляли процесс солюбилизации фракции изоформ цит b₅₅₈. После диализа этой смеси против воды и центрифугирования при 13000об/мин, в течение 20мин, надосадочный раствор подвергали ионобменной хромотаграфии сперва на колонке с целлюлозной КМ-52 (для удаления гемоглобина и других сопутствующих белков основного характера). Не осевшийся на колонке с КМ-52 фракцию далее подвергали ионообменной хроматографии на целлюлозе ДЕ-52 (также уравновешенную 0,002 М калий фосфатным буфером, pH 7,4 (КФБ)). Фракцию цит Ь558 кислого характера из последней колонки элюировали 0,2 М КФБ-ом.

Получение фракции изоформ цит b55S кислого характера из эритроцитарных мембран мышей. Процедуру получения этих гемопротеинов осуществляли также универсальным методом, с использованием ионообменной хроматографии [13]. Из крови мышей (по 1.5мл) эритроциты осаждали добавлением к этой крови физраствора (1:20 мл). После центрифугирования осажденных эритроцитов при pH 5,6 (при 6000 об/мин, 5мин) их подвергали гемолизу в воде (1:10об/об). Эритроцитарные мембраны (ЭМ) осаждали центрифугированием гемолизата при 10000об/ мин, в течение 15мин. Далее, осажденные ЭМ повторно смешивали с водой (1:200об/об) и после центрифугирования в аналогичных условиях осажденные ЭМ смешивали с водой (1:10) и осуществляли процесс солюбилизации суммарной фракции изоформ цит b₅₅₈ ЭМ. После диализа против воды и центрифугирования смеси, из надосадочного раствора фракцию цит b₅₅₈ кислого характера получали также ионообменным хроматографированием, сперва на колонках с КМ-52 и затем на ДЕ-52, как это показано на примере получения цит b₅₅₈ из клеток ткани С-37.

Получение фракции изоформ цит b₅₅₈ кислого характера из клеток ткани селезенки и печени белых мышей. Процедуру получения этой фракции также осуществляли методом [13], сиспользованием ионообменной хроматографии белковых фракций из селезенки (по 0,25г) и печени (по 4,4 г). Разница состоит лишь в том, что гомогенизацию тканей осуществляли стеклянным гомогенизатором с тефлоновым пестиком, со скоростью вращения 500об/мин, при 4^о. Как и прежде из колонки с ДЕ-52, элюлирова- ние фракции цит b₅₅₈ кислого характера из клеток селезенки и печени, осуществляли 0,2М КФБ. Супероксид (О₂^- )-продуцирующую активность фракции изоформ цит b₅₅₈ кислого характера определяли нитротетрозолиевым синим (НТС) методом, путем вычисления процента стимулирования образования формазо- на (при 560нм) в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу О₂^- -продуцирующей активности принимали количество белка, которое стимулирует образование формазана на 50%. При этом NADPH зависимую О₂^- -продуцирующую активность цит b₅₅₈ определяли заранее инкубировав этот гемопротеин с NADPNa₄ (10^-4М) в течение 20мин при 4^о. В этой реакционной смеси (3мл) величина плотности поглощения (при 530нм) цит b₅₅₈ составляла 0,03. Ферригемоглобин (ферриHb)- восстанавливающую активность изоформ цит b₅₅₈ определяли следующим путем, имея в основании то явление, что при аэробном инкубировании цит b₅₅₈ и ферриHb, происходит восстановление ферриHb до феррoHb in vitro [9]. В частности, был использован электрофоретически гомогенный ферриHb из эритроцитов крыс. К 3мл этого ферриHb (с А₅₆₅=0.9) добавляли цит b₅₅₈ из различных источников (эритроциты, селезенка, печень и опухоль С-37 мышей) объемом 0,1мл и с А^о₅₃₀=0,3 (плотность оптического поглощения β-полосы на оптическом спектре матричного раствора изоформ цит b₅₅₈). В опытах определения влияния БПП-1 заранее инкубировали цит b₅₅₈ и БПП-1 в течение 15-20мин при 20о (так поступали и при определении влияния БПП-1 на NADPH зависимой 0₂^- -продуцирующей активности цит b₅₅₈), а потом дабавляли ферриНЬ и без перемешивания ставили реакционную смесь при 36^о в течение 5-6ч. Далее, реакционные смеси поместили в стеклянных трубках (5х1см) и регистрировали кинетику снижения изменения плотности а-поглощения (при 565нм) ферриНb, инкубировав реакционную смесь в течение 4-хч, при 20^о. Постепенное восстановление ферриНЬ до ферроНb сопровождается снижением плотности а-поглощения ферриНb. Это снижение прямо пропорционально образованию ферроНb (при 555нм). За единицу ферриНЬ-восстанавливающей активности принимается количество цит b₅₅₈, вызывающего снижение плотности а-поглощения ферриНb до 0,05 в течение 30мин, при 20^о. Синтетический аналог богатого пролином полипептида из нейросекреторных гранул [10] использовали в количестве до 4мкг. Оптические спектры поглощения были регистрированы на спектрофотометре „Specord UV/VIS″ (Германия) с длиной оптического пробега 1см. В ходе работ были использованы центрифуги К-70 и К-24 (Германия).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера, с определением критерия достоверности „Р".

Результаты и обсуждение

Впервые, по ранее разработанному методу [13], получены фракции изоформ цит b₅₅₈ из клеток опухолевой ткани саркомы-37 (С-37) мышей, а также из клеток селезенки, печени и эритроцитарных мембран здоровых мышей. В отличие от других методов, получение этих гемопротеинов, настоящим, сравнительно простым методом фракции изоформ цит b₅₅₈ из приведенных тканей получается в течение всего 5-6ч.с выходом 65-68%. Удельное содержание фракций изоформ цит b₅₅₈ (в расчете на 1мл фракции и 1г ткани или 1 мл эритроцитов) -плотность оптического поглощении β-полосы (А₅₃₀ нм) таковы:

0.45 ± 0.03 (для цитb₅₅₈ из клеток С-37);

8,10 ± 0,5 (для цит b₅₅₈ из клеток селезенки);

4,12 ± 0.3 (для цит b₅₅₈ ЭМ);

1,21 ± 0,1 (для цит b₅₅₈из клеток печени).

Эти данные свидетельствуют о том, что по сравнению с клетками других тканей в клетках С-37 содержание изоформ цит b₅₅₈ несравнительно низкое. Получение цит b₅₅₈ из клеток С-37, из клеток печени, селезенки и из ЭМ в окисленном и в востановлен- ном состоянии показывают характерные для цит b₅₅₈  из тканей крыс или крови человека, спектров (рис.1). После восстановления дитионитом натрия появляется характерное для цитb₅₅₈ поглощение при 558нм. Однако, по величинам оптического спектрального индекса (А₄₁₂/А₅₃₀) фракции изоформ кислого характера цит b₅₅₈ мышей несколько отличаются. Она для цит b₅₅₈ из клеток печени составляет 11, из ЭМ-9,8; из клеток селезенки-8,2 и из клеток С-37-11,6. Все полученные фракции изоформ цит b₅₅₈ из тканей мышей (включая и цит b₅₅₈ из клеток С-37) являются водорастворимые гемопротеины, и все они обладают как NADPHзависимой О₂ ^- -продуцирующей, так и ферриHb-восстанавливающей активностями (рис 2,3).

Рис. 1. Оптические спекторы поглощения фракции изоформ цит b₅₅₈ кислого характера: а–из клеток печени в окисленном (1) и в восстановленном (2) состоянии, б–из ЭМ в окисленном (1) и в восстановленном состоянии (2),в–то же самое из клеток селезенки, г– то же самое из клеток С-37

Рис. 2. NADPH зависимая O_2¯ -продуцирующая активность фракции изоформ цит b₅₅₈: из клеток С-37 (1), из клеток селезенки (2), печени (3), из ЭМ (4), из С-37,после 20 минутной инкубации с 4 мкг БПП-1 (5) 

Рис. 3. Кинетические кривые снижения плотности α-поглощения ферриHb (при 565 нм) под влиянием фракции кислого характера цит b₅₅₈ из: а–клеток С-37 (1), печени (2), ЭМ (3), селезенки (4) и после 20 мин инкубирования цит b₅₅₈ из С-37 с БПП-1 (5), б–скорости снижения α-полосы поглощения цит b₅₅₈ (tgα наклона угла кинетических кривых) под влиянием фракции изоформ цит b₅₅₈: из селезенки (1), ЭМ (2), печени (3), из клеток С-37 (4), цит b₅₅₈ из клеток С-37, с 20 мин. инкубированием с 4 мкг БПП-1 (5)

Высокой МАБРИ зависимой О_2¯ -продуцирующей активностью обладают фракции цит b₅₅₈ из клеток С-37, по сравнению с активностью цит b₅₅₈ из печени, селезонки и ЭМ. Интересно то обстоятельство,что низкие дозы БПП-1 (4мкг) повышают NADPH зависимую O₂^- -продуцирующую активность изоформ цит b₅₅₈ из клеток С-37 in vitro (до 16,6 ± 2,1%, Р‹0,05).Возможно, этим путем БПП-1 нарушает окислительно-восстановительный баланс опухолевых клеток, ассоциированного с повышением уровня −O_2¯ , что в свою очередь может вызывать гибель этих клеток. Этот эффект БПП-1 может играть важную роль для выявления антиопухолевого эффекта БПП-1 [11].

По сравнению с другими изоформами цит b₅₅₈ кислого характера, цит b₅₅₈ из клеток ткани С-37 обладает низкой ферриHb-восстанавливающей активностью,как это показано на примере снижения плотности максимального оптического поглощения ферриHb с характерной кинетической зависимостью (рис. 3а).Наклон угла этих кинетических кривых (А₅₆₅/ч)–tgα соответственно выше у цит b₅₅₈ из клеток селезенки,затем из ЭМ. Цит b558 из клеток С-37 обладают сравнительно низкой ферриHb-восстанавливающей активностью. Инкубировании цит b₅₅₈ из клеток С-37 с БПП-1 (также до 4мкг) вызывают существенное повышение ферриHb-восстанавливающей активности этого цит b₅₅₈ (рис. 3 б). Нетрудно заметить, что возможно и этим механизмом БПП-1 проявляет антиопухолевый эффект, вызывая чрезмерное стимулирование кислородного гомеостаза опухолевых клеток.Это может быть объяснено тем обстоятельством, что опухолевые клетки очень чувствительны к нарушениям аэробных метаболических процессов и их выживаемость снижается, как в результате увеличения физиологического уровня − O_2¯ , так и повышения физиологического уровня антирадикальной защитной системы [11]. Необходимо подчеркнуть, что активность −O_2¯-продуцирующих систем в опухолевых клетках превышает активности антиоксидантной системы до 10 раз и любое нарушение баланса между анти- и прооксидантной системы приводит к гибели опухолевых клеток. Фактически, цит b₅₅₈ из опухолевых клеток С-37 у мышей обладает низкой ферриHb-восстанавливающей активностью, по сравнению с другими изоформами цит b₅₅₈ из клеток ткани мышей.

Таким образом, впервые с использованием простого метода ионообменной хроматографии на целлюлозах КМ-52 и ДЕ-52, получены фракции изоформ цит b₅₅₈ из клеток опухолевой ткани С-37 мышей, а также из других тканей здоровых мышей, сравнительно в коротких сроках (до 5-8 ч). Эти цит Ь558 по форме и по максимумам оптического поглощения практически не отличаются от показателей цит b₅₅₈  полученных из других источников. Фракция изоформы цит b₅₅₈ кислого характера из клеток мышей с C-37 обладает повышенной NADPH зависимой O_2¯  -продуцирующей активностью и пониженной ферриНb- восстанавливающей активностью, а БПП-1 (4мкг) увеличивает эти активности in vitro, которые могут считаться как возможные механизмы антиопухолевого действия БПП-1.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы МНТЦ А-1701.

Список литературы 

1. Shiota M; Moris S; Imajoh-Ohmi S; Nakamura M; Kanegasaki S; Serizawa H; Izumo T; Uehara T Pathol. Res. Pract; 1993, 189 (9), 985-991.
2. Juhasz A; Ge Y; Markel S; Chiu A; Matsumoto L; van Bagooy J; Ray K; Doroshov J.H. Free Radie. Res; 2009, 43 (6), 523-532.
3. Fu X; Beer D. G; Behar J; Wands J; Lambeth D; Cao W. J. Biol. Chem; 2006, 281 (29), 20368-20382.
4. Edderkaoui M; Hong P; Vaquero E.C; Leej K; Fisher L; Friess H; Buchler M.W; Lerch M.M; Pandol S.I; Gukovskaya A.S. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol; 2005, 289 (6), G 1137-G-1147.
5. 5.Jlonen J.K; Rgsgnen J.V; Sihvo E.I; Knuuttila A. et al. Acta Oncol; 2009, 48 (7), 1054-1061.
6. Vignais P.V. Cell. Mol. Life Sci., 2002, 59 (9), 1428-1459.
7. Taille C. El-Benna J. et al. J. Biol. Chem., 2005, 280 (27), 25350-25360.
8. Ushio-Fukai M. Sci. STKE, 2006, 349, p. re 8.
9. Simonyan G.M; Simonyan R.M; Simonyan M.A. Electronic J. of Natural Sciences, NAS RA, 2006, 2 (7), 3-6.
10. Galoyan A.A. Plenum publishers., N.-Y; 2004, 188 p.
11. Симонян Г.М; Нерсесян А.К; Симонян Р.М; Бабаян М.А; Симонян М.А; Галоян А.А. Нейрохимия, 2005, 22 (2), 125-130.
12. Пароникян Е.Т; Акопян Ш.Ф; Норавян А.С. и др. Хим. Фарм. Ж., 2009, 43 (2), 17-21.
13. Симонян Г.М; Симонян Р.М; Симонян М.А. Получение цитохромов b558 из клеточных компонентов. Лицензия изобретения Армпатента А-2233, 2008 г. 

Вопросы, ответы, комментарии