Med-Practic
Посвящается выдающемуся педагогу Григору Шагяну

События

Анонс

У нас в гостях

Aктуальная тема

Вестник Хирургии Армении им. Г.С. Тамазяна 2.2010

Поведение клеток нейробластомы в процессе культивирования и при воздействии биологически активных веществ

Популяции соматических клеток гетерогенны по своей структуре. гетерогенность возникает по причинам нахождения клеток на разных фазах митотического цикла, вне цикла, разных этапах дифференцировки, возникновения изменений в генетическом аппарате, неоднородности микроусловий и т. п. в то же время клеточные популяции – устойчивые системы. Их равновесие поддерживается авторегуляцией, которая проявляется в «самоорга-низации» элементов системы.

 

В любой клеточной культуре различается ряд цитоморфологических уровней организации - это: популяция – клетка – ядро – ядрышкo. Культура нейробластомы является удобным объектом для многопараметрического исследования ее функционирования на всех указанных уровнях в норме и под воздействием биологически активных веществ. К несомненным достоинствам нейробластомы, как модели, следует также отнести ее способность сохранять при высокой пролиферативной активности потенции к дифференцировке [4;5;8;13]. Отсюда проистекает возможность одновременного изучения этих основополагающих процессов развития клеточных популяций. Это стало основанием для проведения нами исследования именно на культуре клеток нейробластомы. Целью его было выявление и анализ реакций нейробластомы в ответ на введение в среду третионина и нейротоксина (хлорида алюминия) – соединений, кардинально отличающихся друг от друга характером воздействия на клетки. Согласно литературным данным [13;15;16], третионнин обладает способностью индуцировать и стимулиро-вать дифференцировку клеток, а хлорид алюминия, напротив, оказывать на них цитотоксическое или цитопатическое воздействия. мы поставили задачу, определить степень выраженности реакций нейробластомы на всех уровнях ее организации на присутствие в среде в процессе культивирования этих соединений.

 

Материал и методика.


Клетки нейробластомы (клон SHSY-5Y) высевали в шестилуночные планшеты с покровными стеклами в дозе 2х105 / мл. смеси сред Игл-МЕМ и F-14 (50:50) с добавлением 10% бычьей сыворотки и глутамина и культивировали до образования монослоя. На 24-й ч в часть лунок вводили третионин, в другую – на 48-й ч хлорид алюминия, в третью (последова-тельно в одни те же ячейки) на 24-й ч – третионин и на 48-й – хлорид алю-миния. Таким образом третионин находился в среде 72 ч, хлорид алюминия – 48 ч, хлорид алюминия с третионином также 48 ч. Продолжительность культивирования – 96 ч. Дозу вводимого в среду хлорида алюминия опре-деляли по степени его токсичного воздействия на монослой: [–] нет деструкции, [±] – разрежение монослоя, [+] – деструкция 25%, [++] – 50%, [+++] – 75% монослоя, [++++] – разрушение 100% клеток. В работе использовали разведение хлорида алюминия 7.5 мМ / 2х105 клеток. При этом разведении происходит некоторое разрежение монослоя [±] без признаков деструкции, но проявляются его цитопатические свойства. Дозу вводимого третионина (10μM / 2х105 клеток) устанавливали основываясь на данных литературы [8].

 

Препараты извлекали из ячеек, подсушивали на воздухе при комнатной температуре и фиксировали в 96º этаноле. для выявления днк препараты окрашивали по фёльгену в модификации (1); для выявления рнк – галлоцианином и хромовыми квасцами.

 

Определение масс ДНК (λ=575нм), РНК (λl=634нм) и их цитомор-фометрию производили при увеличении (об. 100/1,30, ок. 100х) на создан-ном в лаборатории анализаторе изображений на базе сканирующего микро-скопа-фотометра SMP-05 (Opton-Feintechnic, ФРГ). Во всех случаях измеря-ли не менее 100 клеток. В качестве диплоидного эквивалента использовали значения массы ДНК в ядрах лимфоцитов человека − 76 усл. ед.

 

Определяли значения следующих параметров: плотность монослоя (число клеток на 0.01мм2 поля зрения), количество разрушенных клеток (%), число митозов на 1000 клеток, (‰), среднее количество ядрышек в ядрах, распределение клеток по числу ядрышек (%), массу ДНК (усл. ед.) в ядрах, их объем (мкм3) и площадь поверхности (мкм2), суммарная масса ДНК (усл.ед.) ядрышек, их суммарный объем и суммарная площадь поверхности, масса РНК (усл. ед.) в цитоплазме, ядрах и ядрышках. Данные обрабатывали статистически, используя программу SPSS 10.01. 

 

Результаты и обсуждение.


Рассмотрим сначала популяционные параметры интактной культуры нейробластомы и тех культур, в среду которых вводили третионин и хлорид алюминия. Как видим (табл. 1), значения плотности монослоя популяций, на которые раздельно воздействовали этими веществами, практически, не отличаются от значений в контроле, но возрастают (на 14,4%), в культуре, в среду которой вводили последовательно оба соединения. При введении третионина и хлорида алюминия раздельно в обоих случаях в полтора-два раза снижалась митотическая активность, а при их введении в одну и ту же среду ее значения выравнивались со значениями в интактной культуре.

 

При введении в среду только третионина, в два раза уменьшалось число разрушенных клеток в монослое, введение же в среду хлорида алюминия приводило к резкому повышению их числа (в 3 раза по сравнению с контролем). При последовательном введении в среду третионина на 24-й, а затем хлорида алюминия на 48-й ч культивирования активность пролиферации выравнивалась с ее активностью в контроле, но число разрушенных клеток в монослое оказывалось все же в 1,5 раза выше, чем в контроле. Можно полагать, что третионин и хлорид алюминия подавляют митотическую активность, стимулируют разрушение клеток и не влияют на плотность монослоя.

 

Таблица 1. Популяционные параметры нейробластомы в интактной культуре и культурах, находившихся под воздействием биологически активных веществ в процессе культивирования ( )

Сроки введения биологически активных веществ (часы)

Число кле­ток на 0,01мм2

Число ми­то­зов на 1000 кле­ток, ‰

Число ра­з­рушен­ных клеток,%

Интактная культура (контроль)

20.0±1.3

1.1±0.30

5.5±4.0

Третионин (24)

19.5±0.6

 0.5±0.05

2.6±0.3

Хлорид алюминия (48)

22.3±1.1

0.3±0.05

16.4±2.0

Третионин (24) и хлорид алюминия (48)

28.7±0.8

1.0±0.10

7.3±2,1

 

Ниже представлены значения массы РНК, объема и поверхности субклеточных структур (цитоплазмы, ядер и ядрышек) клеток нейробластомы в интактной культуре и при введении в среду третионина и хлорида алюминия (табл. 2). Видно, что присутствие в среде каждого из этих соединений отражается на значениях параметров субклеточных структур. При введении в среду хлорида алюминия снижаются показатели содержания РНК, объема и поверхности у всех субклеточных структур клеток. Введение третионина приводит к тем же результатам, за исключением массы РНК, по сравнению с контролем и с культурой, в среду которой вводили только хлорид алюминия, но в несколько большей степени, чем при введении хлорида алюминия. При введении третионина в комплексе с хлоридом алюминия, повышаются значения всех параметров, по сравнению и с контролем, и с культурами, в среду которых вводили раздельно хлорид алюминия или третионин (табл. 2).

 

Таблица 2. Изменения в значениях параметров субклеточных структур нейробластомы под воздействием хлорида алюминия, третионина и ( )

Параметры субклеточных структур

Контроль

В в е д е н и е :

Третио-

нина

Хлорида алюминия

Третионина и хлорида алюминия

Цитоплазма

Масса РНК

66,2±3.9

112.6±5.1

57.3±4.7

116.8±4.3

Объем

653.7±28.2

483.3±21.5

544.8±22.6

844.0±39.1

Поверхность

363.8±10.7

216.9±6.6

284.5±11.5

394.6±9.9

Ядра

Масса РНК

46.9±2.6

64.5±2.1

39.8±4.1

75.0±3.1

Объем

169.8±5.4

124.2±3.2

132.3±12.3

173.2±6.9

Поверхность

100.9±2.3

76.5±7.4

75.3±7.1

109.0±2.9

Ядрышки

Суммарная масса РНК

7.3±0.4

9.6±0.5

6.1±1.1

10.9±0.4

Сумарный объем

5.9±0.3

6.5±0.3

5.6±0.5

6.8±0.3

Полная поверхность

12.2±0.6

13.0±0.6

12.9±1.2

13.9±0.6

 

 Присутствие в среде этих соединений влияет не только на фенотипические параметры клеточной популяции нейробластомы, но и на параметры, имеющие прямое отношение к генетическому аппарату клеток, такие, как количество ДНК в ядрах и ядрышках, их объем и полная поверхность (табл. 3). Влияние каждого, из введенных в среду соединений, отличается своеобразием и реакция элементов системы на информацию, полученную от них, также неоднозначна. Ядра отрицательно реагируют на нее почти по всем параметрам: значения содержания ДНК, объема и поверхности ядер при их введении снижаются по сравнению с контролем, но особенно значительно под воздействием комплекса третионин+AlCl3. Также реагируют и ядрышки, но в отличие от ядер их реакция выражена сильнее, по сравнению с контролем и с влиянием третионина и хлорида алюминия в отдельности. Они особенно сильно снижаются под воздействием третионина (по сравнению с контролем в 2-3 раза). Отрицательное влияние хлорида алюминия в отдельности и в комплексе с третионином выражено несколько слабее (табл.3). 

 

Таблица 3. Количество ДНК, объем и полная поверхность ядер и ядрышек клеток нейробластомы без воздействия (контроль) и при введении в среду на разных сроках культивирования БАВ ( ).

Время введения био­ло­гически ак­тивных веществ в среду (часы)

Я д р а

Я д р ы ш к и

(суммарные значения)

Содержание ДНК

Объем

Поверхность

Содержание ДНК

Объ­ем

Полная поверхность

Контроль

120.3±3.8

263.9±8.9

99.8±2.8

12.0±0.7

6.2±0.3

10.0±0.5

Третионин (24)

117.6±2.4

227.9±6.5

79.5±2.0

5.8±0.5

2.9±0.2

3.5±0.3

Хлорид алюминия(48)

106.4±2.4

221.2±8.5

79.5±2.0

8.2±0.4

2.6±0.1

3.9±0.2

Третионин (24) и хлорид алю­миния (48)

95.1±2.2

164.8±7.6

71.7±1.4

8.4±0.5

3.8±0.3

8.0±0.5

 

Выше мы отмечали, что культуры клеток гетерогенны по своему составу. Гетерогенность распространяется и на такие параметры, как распределение клеток в популяции по плоидности и по числу ядрышек в ядрах. Ниже приведены данные о количестве эуплоидных клеток в популяциях. 

 

Как видим (табл. 4), доля таких клеток даже в интактной популяции нейробластомы невелика и составляет всего 36%. При введении же в среду третионина в комплексе с хлоридом алюминия, число эуплоидных клеток в популяции возрастает, по сравнению с контролем и выравнивается с культурой, в среду которой вводили только третионин. Еще более интересны данные о распределении клеток в популяциях по плоидности. Оказалось (табл. 5), что во всех популяциях диплоидные клетки присутствуют в меньшинстве и меньше всего их в популяции культуры, на кото-рую воздействовали хлоридом алюминия. В культурах, обработанных третионином или третионином в комплексе с хлоридом алюминия, диплоидных клеток в два раза больше. Гиподиплоидные клетки во всех популяциях отсутствуют. Наибольшую долю, при этом, составляют гипердип-лоидные (Н2с), тетраплоидные (4с) и гипертетраплоидные (Н4с) клетки. Эти данные подтверждают результаты, полученные нами ранее (3) о гетероплоидности клеток нейробластомы, что скорее всего связано со степенью трансформированности клеток нейробластомы. Заметим, однако, что октаплоидные клетки в популяциях отсутствуют, а появление клеток с «промежуточным» (Н2с и Н4с) содержанием ДНК в ядрах может быть связано с пребыванием их в S-фазе клеточного цикла или развитием нуклео-лиза. Об этом свидетельствует достаточно большая доля в популяциях разрушенных клеток (см. выше: табл. 1).

 

Таблица 4. Эуплоидные клетки в популяции нейробластомы на 96-й ч культивирования в контроле и изменение их числа под действием третионина и хлорида алюминия.

Контроль

В в е д е н и е :

Хлорида алюминия

Третионина

Трe­тионина и хло- рида алюминия

Количество эуплоидных клеток в популяции в %

36

48

56

56

 

Не меньший интерес представляет распределение клеток нейро-бластомы по числу ядрышек в их ядрах. Вообще, наличие и число ядрышек, их размеры и полная поверхность могут служить показателями функциональной активности клеток и степени их дифференцированности [12]. В ряде исследований, проведенных на трансформированных клетках, были вы-явлены повышенная активность ядрышек [6,7,11,12] и увеличение их числа [14]. Анализ распределения клеток в популяциях по числу ядрышек в их ядрах (табл. 6) показал, что в популяции интактной культуры больше всего дву- и трехядрышковых клеток (42% и 30% соответственно). Присутствуют в небольшом числе и четырехядрышковые клетки (6%). Безядрышковые и одноядрышковые клетки отсуствуют. В культуре, обработанной хлоридом алюминия, наоборот, самую большую долю в популяции составляют безяд-рышковые (58%) и одноядрышковые (36%) клетки. Двуядрышковых значительно меньше (6%), а трех- и четырехядрышковых клеток вообще нет. В популяции культуры, в среду которой вводили третионин, доля безядрышковых и одноядрышковых клеток сокращается до 18-и 28-и процентов соответственно, но зато число двуядрышковых клеток возрастает до 50% популяции. В распределении клеток по количеству ядрышек в ядрах в популяции культуры, в среду которой вводили третионин вместе с хлоридом алюминия, наблюдается тенденция, схожая с таковой в интактной культуре, а именно: резкое сокращение доли безядрышковых и одноядрышковых клеток (до 2-х и 6-и процентов, соответственно) и столь же резкое увеличение доли двуядрышковых (до 48-и %) и трехядрышковых до (30-и %) клеток. Следует отметить также достаточно заметное (14%) появление в популяции четырехядрышковых клеток (табл. 6). Из материала, представленного выше, очевидно, что наличие и число ядрышек в ядрах является достаточно динамичным элементом клеточной организации, весьма чувствительным к разного рода воздействиям на клетку, что ранее было описано нами [2,9,10] и другими авторами.

 

Таблица 5. Распределение клеток нейробластомы на 96й ч культивировани по плоидности в контроле и в культурах, находившихся под действием биологически активных веществ (%). 

Плоидность

Интактная культура (контроль)

В  в  е  д  е  н  и  е :

Хлорида алюминия

Третионина

Третионина и хлорида алюминия

8

6

12

12

Н2с

44

36

40

44

28

42

46

44

Н4с

20

16

2

0

 

Таблица 6 Распределение клеток нейробластомы на 96-й ч культивирования по числу ядрышек в их ядрах в контроле и в культурах, находившихся под действием биологически активных веществ, %.

Число ядрышек в ядрах

Конт-роль

В  в  е  д  е  н  и  е :

Хлорида алюминия

Третио-нина

Третионина и хло-рида алюминия

К о л  и  ч  е  с  т  в  о  к л  е  т  о  к

Нет ядрышек

-

58

18

2

1

22           -

36

28

6

2

42

6

50

48

3

30

-

4

30

4

6

-

-

14

 

На основании полученных данных, можно утверждать, что третионин и хлорид алюминия, несомненно, следует считать биологически активными веществами разнонаправленного действия. При введении в культуральную среду они вызывают ответные реакции на всех уровнях организации структуры нейробластомы от субклеточного до популяционного – третионин индуцирует дифференцировку клеток и активирует рост культуры, несмотря на присутствие в среде хлорида алюминия. Последний действует независимо от третионина и подавляет рост культуры нейробластомы, даже в том случае, когда он был введен в среду вместе с третионином. Это свойство хлорида алюминия можно попытаться использовать при лечении онкологических заболеваний, может быть, даже в комплексе с третионином. Вообще, результаты нашего исследования позволяют утверждать, что третионин и хлорид алюмининя как биологически активные вещества, действуют независимо, никак не влияя на проявление свойств друг друга. 

 

Литература

 

  1. Магакян Ю.А., Каралова Е.М. 1989. Цитофотометрия ДНК. Ереван, Изд. АНАрм. ССР, 204с.  
  2. Магакян Ю.А., Каралова Е.М., Аброян Л.О., Акопян Л.А. 2006. Поведение клеток лимфоидной популяции, их ядер и ядрышек при периодической болезни и лейкозе. Бюлл. экспер. биол. мед., 145 (2) : 162-166.
  3. Магакян Ю.А., Каралян З.А., Каралова Е.М., Аброян Л.О., Акопян Л.А., Гаспарян М.Г., Джа-гацпанян Н.Г., Семерджян З.Б., Тер-Погосян З.Р. 2009. Многопараметрическое исследование и кластер-анализ перевиваемых культур клеток человека. Цитология, 51 (1) : 18-23.
  4. Никольский Н. Н., 1984. Пролиферация клеток в культуре. В кн.:Биология клетки в культуре. Л.: Наука. 10-49.
  5. Фридлянская И.И. 1984. Постоянные клеточные линии, дифференцирующиеся in vitro. В кн.: Биология клетки в культуре. Л., Наука : 50-100.
  6. Crocker J. 1990. Nucleolar organizer regions. Curr. Top. Pathol. 82 : 91 - 149. 
  7. Derenzini M., Trere D., Pession A., Govoni M., Sirri V., Chieco P. 2000. Nucleolar size indicates the rapidity of cell proliferation in cancer tissues. J. Pathology. 19 : 181-186.
  8. Farooqui S.M. 1994. Induction of adenylate cyclase sensitive dopamine D2-receptors in retinoic acid induced differentiated human neuroblastoma SHSY-5Y cells. Life Sci. 55 (24) :1887-1893.
  9. Karalyan Z.A., Djaghatspanyan N.G., Gasparian M.H., Hakobyan L.H., Abroyan L.O., Magakian Yu.A., Ter-Pogosian Z.R., Kamalyan L.A., Karalova E.M. Morphometry of nuclear structures in CaCo-2 sell line. Cell Biol. Int., 2004, v. 28,  N 10, p. 249-253 
  10. Karalyan Z.A., Jaghaatspanyaan N.G., Gasparyan M.H., Hakobyan I.A., Abroyan L.O., Ter-Pogossyan Z.R., Kamalyan L.A., Karalova E.M. Comparison of impact of EMCV replication on the nuclear apparatus of NIH 3T3 and Hep-2 cells. Cell Biology International 2005, v.28, N6, P. 587-591.
  11. Mamaew N.N., Mamaewa S.E. 1990. Nucleolar organizer region activity in human chromosomes and interphase nuclei of normal, leukemic, and tumor cells as evaluated by silver staining. Int. Rev. Cytol. 121 : 233 - 266.
  12. Mamaewa S.E. 1998. Karyotypic evolution of cells in culture: a new concept. Int. Rev. Cytol., 178 : 1 - 40.
  13. Scott I.G., Akerman K.E., Heikkila J.E., Kaila K., Andersson L. 1986. Development of a neural phenotype in differentiating ganglion cell-derived human neuroblastoma cells. J. Cell Physiol. 128 (2) : 285-292.
  14. Slater L.M., Sweet P., Hsu T.C., Chan P.K. 1992. Novel nucleolar and nuclear morphology in a vincristine-dependent human leukem cell line. Exp. Cell Res. 198 : 170-174. 
  15. Toimela T., Tahti H. 2004. Mitochondrial viability and apoptosis induced by aluminum, mercuric mercury and methylmercury in cell lines of neural origin. Arch Toxicol. 78 (10) : 565-574.
  16. Toimela T., Maenpaa H., Mannerstrom M.T., Tahti H. 2004. Development of an in vitro blood-brain barrier model-cytotoxicity of mercury and aluminum. Toxicol. Appl. Pharmacol. 195 (1) : 73-82.

Автор. Семерджян З.Б. Институт молекулярной биологии НАН РА.
Источник. Вестник Хирургии Армении им.Г.С. Тамазяна 2.2010
Информация. med-practic.com
Авторские права на статью (при отметке другого источника - электронной версии) принадлежат сайту www.med-practic.com
Share |

Вопросы, ответы, комментарии

Читайте также

Сурен Христофорович Авдалбекян (к 90-летию со дня рождения)
Сурен Христофорович Авдалбекян (к 90-летию со дня рождения)

Обладая прошлым, сравнимым с историей таких древних циви-лизаций, как Египет, Вавилон, Ассирия, Персия и другие, многие из которых канули в лету, Армения сохранилась до наших дней. На этом пути наша страна пережила периоды взлетов и падений, (вторых было больше), в течение многих веков лишилась государственности, однако, то обстоятельство, что мы есть, что мы трудимся и созидаем, говорит об изначальной предопределенности судьбы нашего народа и ее миссии...

Из жизни отечественных врачей
Апоян Виктор Татевосович (к 80-летию со дня рождения)
Апоян Виктор Татевосович (к 80-летию со дня рождения)

Профессор Виктор Апоян является одним из лучших представителей хирургов второй половины прошлого века.

Ему присущь многогранный хирургический талант, вдумчивость настоящего клинициста. В роли председателя научного хирургического совета ‘’Альма матер’’ он был неподражаем и своими глубокими аналитическими способностями направлял научную деятельность совета в правильные русла.  Проф. КАРАПЕТЯН Э.Т.


Апоян Виктор Татевосович родился 29 мая 1930 г. в семье служащего в г. Тбилиси...

Из жизни отечественных врачей
Применение противоспаечных средств в профилактике спаечной болезни живота (oбзор литературы)

Спаечная болезнь живота – одна из сложнейших и не до конца решённых проблем абдоминальной хирургии [1,2,3,9,10,17,19,117]. Хирургическая мысль была всегда занята поиском профилактики спаечной болезни...

Хирургия Обзоры
Хирургическое лечение рака дистального oтдела прямой кишки - проблемы и решения (oбзор литературы)

Проблема хирургического лечения рака прямой кишки приобретает все большее социальное значение. В последние десятилетия отмечается рост показателей заболеваемости больных злокачественными...

Гастроэнтерология, гепатология Онкология Хирургия Обзоры
Выбор реконструкции пищеварительного тракта pосле гастрэктомии (oбзор литературы)

Гастрэктомия  является наиболее распространенной операцией в онкохирургии рака желудка. Развитие хирургической техники, анестезиологии, применение расширенных и расширенно-комбинированных операций...

Гастроэнтерология, гепатология Хирургия Обзоры
Современные аспекты реализации программы ЭКО и ПЭ у женщин с доброкачественными опухолями яичников (обзор литературы)

Вопросы диагностики и лечения бесплодного брака относятся к числу актуальнейших проблем современной медицинской науки и практики и имеют большое социальное значение в связи со значительной частотой...

Перинатология, акушерство и гинекология Обзоры
Новая модификация реконструкции с аборальным резервуаром после гастрэктомии

Гастрэктомия является наиболее распространенной операцией в онкохирургии рака желудка. Развитие хирургической техники, анестезиологии, применение расширенных и расширенно-комбинированных операций...

Гастроэнтерология, гепатология Хирургия
Случай лечения ранней спаечной кишечной непроходимости лапароскопическим методом

 

Развитие абдоминальной хирургии неизбежно сопровождается  ростом частоты послеоперационных осложнений [1,4,8,12]. Как следствие постоянно растущего количества операций, доля острой спаечной кишечной...

Гастроэнтерология, гепатология Хирургия Клинические случаи
Первый опыт лапароскопического ушивания перфоративной язвы

 

Перфорация пептической язвы желудка и двенадцатиперстной кишки является грозным осложнением, требующим неотложного хирургического вмешательств. Предложены различные методы ушивания перфоративных язв...

Гастроэнтерология, гепатология Хирургия Клинические случаи
Повреждение прямой кишки, вызванное длительным воздействием инородного тела

Ранения прямой кишки обычно обусловлены разовым воздействием острых и колющих предметов как со стороны прямой кишки, так и с поверх-ности перианальной кожи. В этой связи вызывает интерес наблюдение...

Гастроэнтерология, гепатология Хирургия Клинические случаи
Дерматолипэктомия при лечении вентральных грыж

 

Грыжи брюшной стенки являются одним из наиболее распространенных хирургических заболеваний. Увеличение продолжительности жизни населения и ежегодное увеличение числа операций на органах...

Хирургия
Экстракционно-спектрофотометрическое определение ампициллина акридиновым красителем акидиновым желтым

Натриевая соль 6-[-Д(-)-α-аминофенилацетамидо]-пенициллиновой кислоты. Порошок белого цвета, горького вкуса. Легко растворима в воде, растворима в спирте. Гигроскопичен...

Фармакология

Notice: Undefined index: HTTP_X_FORWARDED_FOR in /sites/med-practic.com/classes/flud_class.php on line 33

САМЫЕ ЧИТАЕМЫЕ СТАТЬИ