Նեյրոբլաստոմային բջիջների մետաբոլիկ փոփոխությունները ալյումինիումի իոնների ազդեցությամբ

Տարբեր ախտաբանական պրոցեսների ժամանակ նեյրոբլաստոմային ծագման բջիջների տրանսկրիպցիոնալ ակտիվության փոփոխությունները վաղուց հայտնի են: Ողնաշարավորների նյարդային համակարգի նորմալ վիճակը բնութագրվում է կայուն քիմիական պրոցեսներով և մետաբոլիկ վիճակով: Բջջի ընդհանուր վիճակի բնութագրման առավել զգայուն ցուցանիշներից է ընդհանուր ՌՆԹ-ի պարունակությունը [1]: Այսպիսով, նեյրոբլաստոմային ծագման բջիջների տրանսկրիպցիոնալ ակտիվության փոփոխությունների ուսումնասիրումը դրանց ֆիզիոլոգիական վիճակի օբյեկտիվ պատկերը ստանալու հարմար մեթոդ է: Մեր աշխատանքի նպատակն էր հետազոտել հայտնի նեյրոտոքսինի` ալյումինիումի իոնների [2] ազդեցությունը մարդու նեյրոբլաստոմային կուլտուրայի SHSY5Y բջիջների ՌՆԹ-ի պարունակության վրա: 

Նյութը և մեթոդները

Օգտագործվել են SHSY5Y - մարդու նեյրոբլաստոմայի շարունակական գծի բջիջներ, որոնք աճեցվել են Eagle DMEM և F12 1:1 հարաբերությամբ սննդային միջավայրում` ավելացրած 10% շիճուկ: Ցանքսային դոզան է 2x105 բջիջ/մլ: Ցանքսից 48 ժամ հետո ստացվում է նեյրոբլաստոմային բջիջների միաշերտ աճ: Նուկլեինաթթուների պարունակության ուսումնասիրման համար բջիջները աճեցվել են վեց փոսիկավոր ծածկապակիների հարթակներում: Նեյրոբլաստոմայի հյուսվածքային բջիջների միաշերտ աճի ձևավորվելուց 48 ժամ հետո ալյումինիումի իոններ են ներմուծվել միջավայր: Օգտագործվել է ալյումինիումի քլորիդի 7,5 մմոլ դոզայով ստանդարտ պատրաստուկ [3]: 48 ժամ անց բջջային կուլտուրայով ծածկապակիները ֆիքսվել են ստանդարտ մեթոդով:

Նուկլեինաթթուների ցիտոֆոտոմետրիա. ԴՆԹ-ի քանակությունը որոշվել է ցիտոֆոտոմետրով, Ֆյոլգենի եղանակով ներկումից հետո` ալիքի երկարությունը` 575 նմ, ՌՆԹ-ի քանակությունը որոշվել է ցիտոֆոտոմետրով Զանդրիտերի [4] եղանակով ներկումից հետո` ալիքի երկարությունը` 634 նմ:

Ցիտոմորֆոմետրիան անցկացվել է սկաներացնող մանրադիտակ-ֆոտոմետրի SMP-05 (Opton-Feintechnic) օգնությամբ (խոշորացումը օբ. 100/1,30, օկ. 100x): Բոլոր դեպքերում հաշվարկվել են 100-ից ավելի բջիջներ: Որպես դիպլոիդ համարժեք, օգտագործվել է մարդու լիմֆոցիտների կորիզների ԴՆԹ` ընդհանուր քանակը` 76 պայմանական միավոր:

Արդյունքները

Նկատի է առնվել, որ բոլոր բջջային գծերի բջիջները իրենց կազմով այս կամ այն չափով հետերոգեն են: SHSY5Y բջիջների հետերոգենությունը առավել լավ արտահայտվում է նրանց պլոիդության դասերի ուսումնասիրության միջոցով, որի տվյալները բերված են նկար 1-ում:

Ինչպես երևում է նկարից, ալյումինիումի իոնների ազդեցությամբ դիտվում է բջիջների քանակի աճ 4c գոտում` 2c գոտում բջիջների քանակի միաժամանակյա նվազման պայմաններում: Դա հանդիսանում է բջիջների արգելափակման արտահայտում G2 փուլում: 

Ուսումնասիրվել են նաև բջջային կուլտուրաների բջջաչափական ցուցանիշները: Ստացված տվյալները բերված են աղյուսակ 1-ում:  

Նկար 1. ԴՆԹ-ի բաշխումն ըստ պլոիդության դասերի ստուգիչ խմբում, և ալյումինիումի իոնների ազդեցության տակ` SHSY5Y բջիջներում

Նկար 2. SHSY5Y բջիջների տրանսկրիպցիոնալ ակտիվությունը ստուգիչ խմբում և ալյումինիումի իոնների ազդեցության տակ

Աղյուսակ 1

Բջիջների տարբեր կառուցվածքների ցիտոմետրիա

Ինչպես երևում է աղյուսակ 1-ից, ալյումինիումի իոնների ազդեցությամբ նեյրոբլաստոմային բջիջներում հավաստի նվազում են ինչպես ողջ բջջի (ցիտոպլազմա), այնպես էլ և կորիզի, և կորիզակի ծավալն ու մակերեսը: Բջջի և բջջային կառուցվածքների բացարձակ չափերի նման նվազումը բջիջների մետաբոլիկ պրոցեսների վրա ալյումինիումի իոնների բացասական ազդեցության մասին է վկայում:

Հաջորդ փուլում ուսումնասիրվել է SHSY5Y բջիջների կորիզներում ԴՆԹ-ի պարունակությունը: Ալյումինիումի քլորիդի ազդեցության ներքո հայտնաբերել ենք բջիջներում ԴՆԹ-ի քանակի հավաստի (p<0.05) ավելացում (4.1±0.2 ստուգիչ խումբ, 4.9±0.3 ալյումինիումի իոնների ազդեցությամբ):

Աշխատանքի հաջորդ փուլը բջիջների տրանսկրիպցիոնալ ակտիվության ուսումնասիրումն էր: Տվյալները ներկայացված են նկար 2-ում: 

Ինչպես երևում է նկար 2-ից, ալյումինիումի իոնների ազդեցության ներքո ՌՆԹ-ի պարունակությունը բջջի բոլոր բաղադրիչներում (կորիզ, կորիզակ, ցիտոպլազմա) նվազել է: Հարկ է նշել, որ եթե կորիզակում ստացված տվյալները հավաստի չեն, ապա կորիզի և ցիտոպլազմայի ցուցանիշներում դիտվում է նվազման տենդենց (p<0.1): Միաժամանակ տեղի է ունեցել նաև մեկ կորիզին ընկնող կորիզակների քանակի նվազում (1.9±0.3 ստուգիչ խումբ, 1.5±0.1 ալյումինիումի իոնների ազդեցությամբ):

Քննարկում

Այսպիսով, մեր կողմից ցույց է տրվել, որ ալյումինիումի իոնների ազդեցությամբ բջիջներն ունակ են արգելափակվելու G2 փուլում: Արգելափակման պատճառ կարող են լինել ԴՆԹ-ի տարբեր վնասումները, որոնք ինքնըստինքյան ունակ են առաջացնելու կանգ ոչ միայն բջջային ցիկլի G1 և S, այլ նաև G2 փուլում: Բացի այդ, G2 փուլում հայտնաբերվում է ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիայի խտությունը, և այն բջիջները, որտեղ ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիան չի ավարտվել, չեն մտնում միտոզի մեջ: Մեր տվյալները հաստատվում են հաղորդագրություններով [5], որոնք վկայում են այն մասին, որ ալյումինիումի իոնների ազդեցությամբ արագանում է ԴՆԹ-ի սինթեզը, սակայն արգելափակվում է բջիջների պրոլիֆերացիան: Ալյումինիումի իոնների վնասող ազդեցության մասին կան բազմաթիվ տվյալներ, սակայն նշվում է, որ G2 փուլում արգելափակված բջիջներում ԴՆԹ-ի վնասում չի դիտվում [6]: Միաժամանակ հարկ է նշել, որ մեր կողմից ցույց է տրվել ալյումինիումի իոնների արգելակող ազդեցությունը ընդհանրապես մետաբոլիկ պրոցեսների վրա, որն արտահայտվում է տրանսկրիպցիոն գործընթացի ընկճումով և բջջի ու կառուցվածքի բացարձակ չափերի նվազմամբ [7]: Հայտնի է, որ ՌՆԹ-ի անբավարար սինթեզն ունակ է նվազեցնելու պրոլիֆերատիվ ակտիվությունը և արգելափակելու բջիջները միտոտիկ ցիկլի տարբեր փուլերում` որպես հետևանք սպիտակուցի անբավարար քանակի, որն անհրաժեշտ է բջջի բաժանման համար:

Գրականության ցանկ

1. Giacobini E. Chemical studies on individual neurons. Part 1. Vertebrate nerves. In S. Ehrenpreis and O. C. Solnitzky (eds). Neuroscience Research New York-London Academic press, 1968, 1, 1-71p.
2. Zatta P., Lain E., Cagnolini C. Effects of aluminum on activity of Krebs cycle enzymes and glutamate dehydrogenase in rat brain homogenate. Eur. J. Biochem. 267: 3049-3055. 2000.
3. Каралян Н. Ю. Сравнительный анализ токсического действия алюминия на культуры клеток человека. Медицинская наука Армении. 2006, 1; 111-114.
4. Зандриттер В., Кифер Г., Рик В. Галлоцианин-хромовые квасцы. В кн.; Введение в количественную цитохимию. М.; Мир. 240-264., 1969.
5. Dominguez C.; Moreno A.; Llovera M. Aluminum Ions Induce DNA Synthesis But Not Cell Proliferation in Human Fibroblasts In Vitro. Biological Trace Element Research, Vol 86, 1, 2002 , pp. 1-10(10).
6. Anisimov A.G, Bolotnikov I.A. Treatment of synchronized K562 cells by tetrafluoroaluminate does not modulate the fluorescence of ethidium bromide and 4'6-diamidine-2-phenylindole in case of the binding with nucleoid DNA. Tsitologiia. 1999;41(8):680-4.
7. Kruger S., Muller H. Correlation of morphometry, nucleolar organizer regions, proliferating cell nuclear antigen and Ki67 antigen expression with grading and staging in urinary bladder carcinomas. Br J Urol. 1995;75(4):480-4

Հարցեր, պատասխաններ, մեկնաբանություններ