IN SITU հիբրիդացման մեթոդի նշանակությունը ուռուցքների ախտորոշման գործում

Բանալի բառեր` in situ հիբրիդացում, FISH, CISH, HER2

Ուռուցքներում առաջացող գենային փոփոխությունները հայտնաբերելու նպատակով ժամանակակից բժշկության մեջ կիրառվում են մի քանի եղանակներ, որոնցից առավել լայն կլինիկական նշանակություն են ստացել իմունոհիստոքիմիական, ֆլուորեսցենտային in situ հիբրիդացման (FISH) և քրոմոգենային in situ հիբրիդացման (CISH) մեթոդները [1]:

Իմունոհիստոքիմիական մեթոդը հնարավորություն չի տալիս ուղղակիորեն հայտնաբերել գենային փոփոխությունները: Այս հետազոտության ժամանակ օգտագործվում են հակամարմիններ, որոնց միջոցով որոշվում է բջջում սպիտակուցների քանակական փոփոխությունները և դրա հիման վրա կատարվում է եզրակացություն գենային փոփոխությունների մասին, օրինակ, բջջում որևէ սպիտակուցի քանակի շատացումը թույլ է տալիս ենթադրել այդ սպիտակուցը կոդավորող գենի ամպլիֆիկացիայի մասին: Հասկանալի է դառնում, որ բջջում գենային փոփոխությունները հայտնաբերելու նպատակով կիրառվող իմունոհիստոքիմիական մեթոդը չի կարող ունենալ բավական ճշգրտություն, քանի որ բջջում սպիտակուցի քանակի շատացում կարող է դիտվել նաև առանց գենի ամպլիֆիկացիայի:

Ֆլուորեսցենտային in situ հիբրիդացումը (FISH) և քրոմոգենային in situ հիբրիդացումը (CISH) այնպիսի մեթոդներ են, որոնց միջոցով ուսումնասիրվում են նուկլեինաթթուները: Դա հնարավորություն է տալիս անմիջականորեն ուսումնասիրել կորիզային ԴՆԹ-ն, գնահատել գեների վիճակը և նրանցում առաջացած փոփոխությունները: In situ հիբրիդացման հիմքում ընկած է բջջային ԴՆԹ-ի և արհեստականորեն պատրաստված ԴՆԹ զոնդի միջև կայուն հիբրիդի առաջանալու հատկությունը: ԴՆԹ զոնդն իրենից ներկայացնում է նուկլեինաթթուների հաջորդականություն, որը կոմպլեմենտար է կորիզային ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածին և ընդունակ է նրա հետ հիբրիդ առաջացնել: ԴՆԹ զոնդերը լինում են դրոշմված և դրա շնորհիվ հնարավոր է լինում նրանց հայտնաբերել (նկ. 1): 

Նկ.1. Հիբրիդացում բջջային ԴՆԹ-ի և ԴՆԹ զոնդի միջև

In situ հիբրիդացման մեթոդը ներդրվել է 1969 թվականին, միմյանցից անկախ երկու խումբ գիտնականների կողմից (John et al. և Pardue, Gall.): Այդ ժամանակ ԴՆԹ զոնդերի դրոշմման միակ հասանելի եղանակը ռադիոիզոտոպային ագենտների օգտագործումն էր (իզոտոպային in situ հիբրիդացում` IISH): ԴՆԹ զոնդերը դրոշմվում էին P32 իզոտոպով, իսկ հիբրիդացման արդյունքները գնահատվում էին ավտոռադիոգրաֆիայի մեթոդով, որը բավական բարդ եղանակ էր: Իզոտոպային զոնդերի հետ կապված խնդիրները և հիբրիդացման արդյունքների գնահատման բարդությունները հնարավորություն չէին տալիս in situ հիբրիդացումը կիրառել պրակտիկ բժշկության մեջ [2]:

1980-ականներին ԴՆԹ զոնդերի պատրաստման կատարելագործումը հնարավորություն տվեց ԴՆԹ զոնդերը դրոշմել ֆլուորոքրոմով, որի շնորհիվ հիբրիդացման արդյունքները սկսեցին գնահատել լումինեսցենտային մանրադիտակի միջոցով` ֆլուորեսցենտային in situ հիբրիդացում (FISH): ԴՆԹ զոնդերի պատրաստման այս եղանակը in situ հիբրիդացումը դարձրեց մատչելի, հետազոտողների համար անվտանգ և անհամեմատելիորեն հեշտացրեց արդյունքների գնահատումը: Դրա շնորհիվ FISH մեթոդը սկսեց կիրառվել ոչ միայն գիտահետազոտական նպատակներով, այլև լայնորեն ներդրվեց պրակտիկ բժշկության մեջ [3]: Եվրոպայի և ԱՄՆ-ի առաջատար կլինիկաներում ներկայումս FISH մեթոդը օգտագործվում է հետևյալ նպատակներով.

• քրոմոսոմների որակական և քանակական անոմալիաների հայտնաբերում,
• քրոմոսոմային խանգարումների պրեիմպլանտացիոն, պրենատալ և պոստնատալ ախտորոշում,
• բջիջներում վիրուսների հայտնաբերում,
• ուռուցքային բջիջներում սպեցիֆիկ և ոչ սպեցիֆիկ քրոմոսոմային անոմալիաների հայտնաբերում, որը կիրառվում է նաև օնկոհեմատոլոգիայում,
• ուռուցքային բջիջներում սպեցիֆիկ գեների հայտնաբերում,
• ուռուցքային բջիջներում գենային ամպլիֆիկացիաների հայտնաբերում,
• բուժման արդյունավետության մոնիտորինգ և ուռուցքային բջիջների մնացորդային նվազագույն քանակների հայտնաբերում:

Այս նպատակները իրականացնելու համար սինթեզվել է ԴՆԹ զոնդերի մեծ բազմություն: Ներկայումս գոյություն ունեն սկզբունքորեն իրարից տարբերվող 3 տիպի ԴՆԹ զոնդեր:

1. Քրոմոսոմ յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդեր` կոմպլեմենտար քրոմոսոմների ցենտրոմերային հատվածներին` CEP (Chromosome Enumeration Probe): CEP զոնդերը պարունակում են համեմատաբար կարճ նուկլեինաթթվային հաջորդականություններ, որոնք կոմպլեմենտար են քրոմոսոմների ցենտրոմերային հատվածներին և նախատեսված են քրոմոսոմների քանակական փոփոխությունները հայտնաբերելու համար (անեուպլոիդիա, պոլիպլոիդիա, մոնոսոմիա, տրիսոմիա):
2. Քրոմոսոմ յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդեր` կոմպլեմենտար քրոմոսոմների տելոմերային հատվածներին` TEL: TEL զոնդերը կոմպլեմենտար են քրոմոսոմի p կամ q թևիկների ԴՆԹ-ին և նախատեսված են քրոմոսոմների որակական անոմալիաները հայտնաբերելու համար (դելեցիա, դուպլիկացիա): Դելեցիայի և մոնոսոմիայի միջև տարբերակիչ ախտորոշում կատարելու նպատակով միաժամանակ կիրառվում են TEL և SEP տեսակի ԴՆԹ զոնդեր:
3. Գեն յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդեր LSI (Locus Specific Identifiers): Գեն յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդերը օգտագործում են քրոմոսոմներում յուրահատուկ, չկրկնվող նուկլեինաթթվային հաջորդականություն հայտնաբերելու նպատակով:

Ժամանակակից ֆլուորեսցենտային մանրադիտակները հնարավորություն են տալիս մեկ հետազոտության ժամանակ օգտագործել մի քանի ԴՆԹ զոնդեր, որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում է իրեն բնորոշ գունավորման ֆլուորեսցենտային ազդանշան [4]: Նմանատիպ ԴՆԹ զոնդերի հավաքածու կիրառվում է միզապարկի քաղցկեղի ախտորոշման նպատակով: Dako ընկերության կողմից առաջարկված այդպիսի հավաքածուն պարունակում է երեք քրոմոսոմ յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդեր` 3, 7, 17-րդ քրոմոսոմների անեուպլոիդիաների հայտնաբերման համար, և մեկ գեն յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդ` 9-րդ քրոմոսոմի կարճ թևի 21-րդ լոկուսի դելեցիան հայտնաբերելու համար (9p21-) [5]: Այս զոնդերից յուրաքանչյուրը ունի իրեն բնորոշ ֆլուորեսցենտային գունավորումը` քրոմոսոմ 17-երկնագույն, քրոմոսոմ 7-կանաչ, քրոմոսոմ 3-կարմիր, 9p21-դեղին: Նորմալ դիպլոիդ բջջում այս գունային ազդանշաններից յուրաքանչյուրը ներկայացված է լինում երկու օրինակով (նկ. 2): 

Քաղցկեղային բջջիջներում հանդիպում են 3, 7, 17-րդ քրոմոսոմների անեուպլոիդիաներ և 9p21 լոկուսի դելեցիա: Այս շեղումները կարող են հանդիպել բազում տարբերակներով: Նկար 3-ում բերված է քաղցկեղային բջջի օրինակ, որտեղ կա 3-րդ քրոմոսոմի  երկու  օրինակ (կարմիր ֆլուորեսցենցիա), 7-րդ քրոմոսոմի վեց օրինակ (կանաչ ֆլուորեսցենցիա), 17-րդ քրոմոսոմի վեց օրինակ (երկնագույն ֆլուորեսցենցիա) և 9-րդ քրոմոսոմի կարճ թևի 21-րդ լոկուսի մեկ օրինակ (դեղին ֆլուորեսցենցիա): Հասկանալի է դառնում, որ ունենք 7 և 17-րդ քրոմոսոմների պոլիպլոիդիա և 9-րդ քրոմոսոմի 21-րդ լոկուսի դելեցիա: Սա նորմայից շեղման տարբերակներից մեկն է: Գրականության մեջ կան տվյալներ, որ 3, 7, 17-րդ քրոմոսոմների արտահայտված պոլիպլոիդիան` զուգակցված 9-րդ քրոմոսոմի 21-րդ լոկուսի դելեցիայի հետ, բնորոշ է առավել չարորակ ընթացքով քաղցկեղներին [6, 7]:

Ի տարբերություն դասական ցիտոգենետիկ մեթոդների, FISH մեթոդը հնարավորություն է տալիս ուսումնասիրել ոչ միայն մետաֆազային, այլև ինտերֆազային բջիջները: Հետազոտության համար օգտագործվում է և ցիտոլոգիական, և հիստոլոգիական նյութ: Կան մշակված FISH մեթոդի բազմաթիվ մոդիֆիկացիաներ, որոնք հաջողությամբ կիրառվում են լաբորատոր ախտորոշման տարբեր բնագավառներում [8]:

In situ հիբրիդացման մյուս տարբերակը քրոմոգենային in situ հիբրիդացման մեթոդն է (CISH): CISH մեթոդը մշակվել է վերջին տարիների ընթացքում: Այն սկզբունքորեն նման է FISH մեթոդին, սակայն հետազոտության ժամանակ օգտագործվում են այլ եղանակով պատրաստված ԴՆԹ զոնդեր: CISH մեթոդի դեպքում ԴՆԹ զոնդերը դրոշմվում են քրոմոգենով, իսկ հիբրիդացման արդյունքները գնահատվում են լուսային մանրադիտակով, դրա շնորհիվ մեթոդը պաթոհիստոլոգիական լաբորատորիաներում կիրառելու նպատակով դառնում է առավել հասանելի: Ներկայումս CISH մեթոդը լայնորեն կիրառվում է կրծքագեղձի քաղցկեղի ախտորոշման համար` HER2 գենի ստատուսը որոշելու նպատակով: HER2 գենը տեղակայված է 17-րդ քրոմոսոմում և կոդավորում է համանուն սպիտակուցի սինթեզը: Նորմալ դիպլոիդ բջջում այս գենը գտնվում է երկու օրինակով: Հայտնի է  որ  կրծքագեղձի  քաղցկեղով հիվանդների 20-30%-ի մոտ հայտնաբերվում է HER2 գենի ամպլիֆիկացիա, որով բացատրվում է հիվանդության առավել ագրեսիվ ընթացքը և անբարենպաստ ելքը: CISH մեթոդով HER2 գենի ամպլիֆիկացիան որոշելու համար օգտագործվում է գեն` յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդ կոմպլեմենտար HER2 գենին: Համարվում է, որ ամպլիֆիկացիան բացակայում է, եթե 50%-ից ավելի բջիջներում հայտնաբերվում է 1-5 քրոմոգենային ազդանշան (նկ. 4):

Եթե 50%-ից ավելի բջիջներում կան HER2 գենի 5-ից ավելի օրինակներ, կամ կա քրոմոգենային գունակի կլաստերներ, համարվում է, որ ամպլիֆիկացիան դրական է [9]: HER2 գենի ամպլիֆիկացիայի ճշգրիտ որոշումը շատ կարևոր է, քանի որ դա ոչ միայն հնարավորություն է տալիս կատարել կանխատեսումներ հիվանդության ընթացքի վերաբերյալ, այլև հնարավորություն է ստեղծում ճշգրիտ կատարել քիմիոթերապևտիկ դեղամիջոցի ընտրությունը: Քաղցկեղային բջիջներում HER2 գենի ամպլիֆիկացիայի ժամանակ ցուցված է հերցեպտին (տրաստուզումաբ) դեղամիջոցի նշանակումը:

Հերցեպտինը մոնոկլոնալ հակամարմին է, որը ընտրողաբար կապվում է ուռուցքային բջջի մակերեսին տեղակայված HER2 ռեցեպտորի հետ` թողնելով բջջի վրա ցիտոտոքսիկ ազդեցություն: Այն միաժամանակ ակտիվացնում է նաև ապոպտոզը, ընկճում բջիջների բազմացումը և անգիոգենեզը: Հերցեպտինով բուժման համար անհրաժեշտ է ճշգրիտ հաստատել HER-2 գենի ամպլիֆիկացիան, քանի որ հակառակ դեպքում թանկարժեք դեղամիջոցի օգտագործումը լինում է անարդյունք, իսկ երբեմն վատացնում հիվանդության ընթացքը [10]: Դասական CISH հետազոտության ժամանակ, երբ HER2 գենի օրինակները բջջում լինում են 5-10 հատ (թույլ ամպլիֆիկացիա), խնդիր է առաջանում տարբերակել` դա HER2 գենի ամպլիֆիկացիայի հետևա±նք է, թե 17-րդ քրոմոսոմի պոլիպլոիդիա: Դա կարևոր է, որովհետև վերջինի ժամանակ HER2 գենի օրինակների թիվը նույնպես շատանում է: Տարբերակիչ ախտորոշման նպատակով կատարվում է FISH հետազոտություն կամ երկգույն CISH հետազոտություն, որի դեպքում օգտագործվում է երկու ԴՆԹ զոնդ` դրոշմված տարբեր քրոմոգեններով: Օգտագործվում է քրոմոսոմ յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդ` 17-րդ քրոմոսոմը հայտնաբերելու համար (կարմիր ազդանշան) և գեն յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդ` HER2 գենը հայտնաբերելու համար (կանաչ ազդանշան): Նորմալ դիպլոիդ բջջում երկու տեսակի ԴՆԹ զոնդերն էլ հանդիպում են երկուական օրինակներով (նկ. 6): HER2 գենի ամպլիֆիկացիայի ժամանակ 17-րդ քրոմոսոմը հանդիպում է երկու օրինակով (կարմիր ազդանշան), իսկ HER2 գենը` բազմաթիվ օրինակներով (կանաչ ազդանշան) (նկ. 7):

Իմունոհիստոքիմիական մեթոդով հնարավոր է լինում որոշել HER2 սպիտակուցի հիպերէքսպրեսիան, սակայն դա ախտորոշման օբեկտիվ մեթոդ չի կարող համարվել, քանի որ իմունոհիստոքիմիական մեթոդով որոշվում է բջջում սպիտակուցի քանակական փոփոխությունները և չի պարզվում, թե ինչ է տեղի ունենում բջջում գենային մակարդակով: 

CISH մեթոդի առավելությունը FISH մեթոդի համեմատ կայանում է նրանում, որ հետազոտության այս տեսակի ժամանակ պահպանվում է հյուսվածքի մորֆոլոգիական պատկերը` հնարավորություն տալով նույն պրեպարատի վրա գնահատել և մորֆոլոգիական, և գենետիկ առանձնահատկությունները: Մյուս կողմից` հիբրիդացման արդյունքները գնահատվում են ոչ թե լումինեսցենտային, այլև լուսային մանրադիտակի միջոցով, ինչը անհամեմատ հեշտացնում է այդ պրոցեսը, և երրորդ` CISH մեթոդով ստացված պրեպարատները կարելի է երկար ժամանակ պահպանել, մինչդեռ FISH հետազոտության ժամանակ դա հնարավոր չէ, քանի որ ֆլուորեսցենտային ազդանշանները արագ անհետանում են:

Գրականության ցանկ

1. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Методы иммуногистохимии и гибридизации in situ в онкоморфологии // Медицинская технология, Москва, 2009.
2. Trask B.J. Human Cytogenetics: 46 Chromosomes, 46 Years and Counting // Nature reviews. - 2002.- N3.- P.769-778.
3. Chudoba I., Plesch A., Loerch T. et al. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosomes // Cytogenet. Cell Genet.- 1999.- V. 84.- P.156-160.
4. Домрачева Е.В., Асеева Е.А. Возможности и перспективы гематологической цитогенетики // Медицинская генетика.- 2004.- Т.3, N4.- С.166- 179.
5. Немцова М.В., Михайленко Д.С., Кекева Т.В., Кузнецова О.А., Башкатов С.В., Курынин Р.В., Попов А.М., Попова О.П., Шегай П.В., Андреева Ю.Ю., Алексеев Б.Я., Еникеев М.Э., Аляев Ю.Г., Карякин О.Б., Русаков И.Г., Франк Г.А., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетические маркеры в онкоурологии // Молекулярная медицина, 2007, N3, С.43-54. 
6. Немцова М.В., Землякова В.В., Кузнецова Е.В., Бабенко О.В., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Батева М.В., Франк Г.А., Залетаев Д.В. Анализ корреляции генетических и иммуногистохимических маркеров (гены-регуляторы клеточного цикла RB1, p16 и р53) при спорадическом раке молочной железы // Архив патологии, 2007, том 69, N2, С.3-6.
7. Андреева Ю.Ю., Франк Г.А. Факторы прогноза рака мочевого пузыря // Российский онкологический журнал, 2007, N3, С.47-51.
8. Rubtsov N., Karamysheva T., Babochkina T., Zhdanova N. et al. A new simple version of chromosome microdissection tested by probe generation for 24 - multi - color FISH, multi - color banding (MCB), ZOO - FISH and in clinical diagnostics // Medgen.- 2000.- V.12.- P.- 65.
9. K. Kajo, P. Zubor, M. Barthova, L. Plank. Scoring index for prediction of HER-2 statusin the invasive breast carcinoma// Experimental Oncology 29, 2007 P.281-286
10. Завалишина Л.Э., Ряазанцева А.А., Батева М.Б., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А. Сравнительное исследование определение HER-2-статуса при раке молочной железы методами флюресцентной (FISH) и хромогенной (CISH) in situ гибридизации // Архив патологии, 2008, N3, С.9-11.

Հարցեր, պատասխաններ, մեկնաբանություններ