Թիմիդին ցիկլիկ ԱՄՖ-ԻՆ բջջային պատասխանի ցիտոֆոտոմետրիկ ցուցանիշները in vitro պայմաններում

Բանալի բառեր. թիմիդին-ցԱՄՖ, պրոլիֆերատիվ ակտիվություն, RD բջջային կուլտուրա, ԴՆԹ-ի քանակը կորիզներում

Հայտնի է, որ բջջի վրա ազդող արտաքին գործոնները բազմազան են, որոնց ազդեցությունն իրականանում է որոշակի և կարևոր գործոնների միջոցով: Դրանցից մեկը ցիկլիկ ադենոզին մոնոֆոսֆատն է (ցԱՄՖ) [5], որի մոլեկուլային ցածր կշիռը հնարավորություն է տալիս նրան արագ թափանցել բջջի ներսը և կարգավորել ներբջջային տարբեր պրոցեսներ: Այն համարվում է նաև ֆերմենտների` կինազաների, երկրորդային միջնորդ-ակտիվացնող, որոնք ձևափոխվում են այլ սպիտակուցային ֆերմենտների: Մասնավորապես տեղի է ունենում պրոտեինկինազա A-ին կապակցված ազդանշանային համակարգերի ակտիվացում, պրոտեինկինազա A-ն թափանցելով բջջային կորիզ, ֆոսֆորիլացման է ենթարկում ցԱՄՖ-կախյալ տրանսկրիպցիոն գործոնին (CREB) [4]: 

Մեր աշխատանքի նպատակն էր ուսումնասիրել թիմիդին-ցԱՄՖ-ի ազդեցությունը բջջային ֆիզիոլոգիայի մի շարք ցուցանիշների վրա, մասնավորապես ԴՆԹ-ի սինթեզի: Այդ նպատակով մեր կողմից առաջարկվել է կիրառել in vitro պայմաններ, որպեսզի բացառենք օրգանիզմի միջանկյալ ազդեցությունը: Որպես բջիջներ կիրառվել են մարդու ռաբդոմիոսարկոմայի բջջային կուլտուրաները (RD): Տվյալ գծի բջիջներն առանձնանում են շրջակա միջավայրի գործոնների նկատմամբ բարձր ընկալունակությամբ [1]: 

Նյութը և մեթոդները

Բջջային կուլտուրա (RD) մարդու ռաբդոմիոսարկոմայի գիծ: Բջիջները աճեցվել են Eagle MEM միջավայրում` ավելացրած հորթի 10%-անոց շիճուկ: Ցանքսային դոզան է 2 x 10⁵ բջիջ/մլ: Ցանքսից 24 ժամ հետո ստացվում է ռաբդոմիոսարկոմային բջիջների միաշերտ աճ:

Պոպուլացիոն վերլուծությունը կատարվել է փորձանմուշի ստանդարտ մակերեսի վրա` 0,01 մմ²: Հաշվարկվել են միավոր մակերեսում բջիջների քանակը, մահացած բջիջների քանակը և միտոտիկ ինդեքսը:

Կորիզներում ԴՆԹ-ի պարունակությունն ուսումնասիրելու համար կուլտուրայի բջիջները ցանվել են 6 փոսիկանի հարթակներում` ծածկապակիների վրա: Միաշերտի ձևավորումից հետո սննդային միջավայր միանվագ ավելացվել է թիմիդին ցիկլիկ ԱՄՖ-ն 

(թ-ցԱՄՖ, Sigma), վերջնական խտությունը` 2մՄ: 24, 48 և 72 ժամ անց ծածկապակիները ֆիքսվել են ստանդարտ մեթոդով [2]:

ԴՆԹ-ի քանակությունը որոշվել է ցիտոֆոտոմետրով, Ֆյոլգենի եղանակով ներկումից հետո` ալիքի երկարությունը 575 նմ [2]: Որպես դիպլոիդ համարժեք օգտագործվել են մարդու ծայրամասային արյան չխթանված լիմֆոցիտները: Նույն փորձանմուշներում որոշվել են կորիզի և կորիզակների պարագիծը և կորիզին ընկնող կորիզակների միջին քանակը: 

Արդյունքները 

Պոպուլացիոն փոփոխությունները ստուգիչ և փորձնական` թ-ցԱՄՖ-ի ազդեցությամբ խմբերում բերված են աղյուսակ 1-ում:

Ինչպես երևում է աղյուսակից, թ-ցԱՄՖ-ն ներգործության առաջին 24 ժամվա ընթացքում ընկճում է բջիջների պրոլիֆերատիվ ակտիվությունը` հավաստիորեն իջեցնելով միավոր մակերեսում բջիջների քանակը: Մեռած բջիջների պոպուլացիոն ցուցանիշների  ուսումնասիրման  արդյունքում  հավաստի տվյալներ չեն ստացվել ստուգիչ խմբի համեմատությամբ (տատանումը տարբեր խմբերում` 4,1-6,5%):

Աղյուսակ 1 

RD բջիջների պոպուլացիոն վերլուծության փոփոխությունները ստուգիչ և թ-ցԱՄՖ-ի ազդեցությամբ խմբերում

 * հավաստի ցածր է ստուգիչ խմբի համեմատ (p>0.05-p>0.01)

** հավաստի բարձր է ստուգիչ խմբի համեմատ (p>0.05)

Նկար 1. Ստուգիչ և թ-ցԱՄՖ-ի ազդեցությամբ խմբերում

RD բջիջների կորիզներում ԴՆԹ-ի պարունակության տեղաշարժերը

Նկար 2. Ստուգիչ և թ-ցԱՄՖ-ի ազդեցությամբ խմբերում RD բջիջների

կորիզներին ընկնող կորիզակների միջին քանակի փոփոխությունները

Միտոտիկ ակտիվության նկատելի ընկճումը թ-ցԱՄՖ-ի ազդեցության առաջին ժամերին զգալիորեն բարձրանում է և ստուգիչ խմբի համեմատ կրկնակի ավելանում ազդեցության 24 ժամերի ընթացքում: Սա, անկասկած, կրում է կոմպենսատոր բնույթ, որի հետևանքով փորձի ավարտին ստուգիչ և փորձնական խմբերում բջիջների քանակների միջև տարբերությունը վերանում է:

Նկար 1-ում բերված է ռաբդոմիոսարկոմային բջիջներում ԴՆԹ-ի կուտակման վերաբերյալ տվյալները ստուգիչ և փորձնական` թ-ցԱՄՖ-ի ազդեցությամբ խմբերում: 

Ինչպես երևում է նկար 1-ից, թ-ցԱՄՖ-ի ազդեցությամբ ինկուբացիայի առաջին 24 ժամերի ընթացքում հայտնաբերվել է ԴՆԹ-ի կուտակման ցուցիչի հավաստի աճ: Երկրորդ ինկուբացիոն ժամանակահատվածից հետո, երբ տարբերությունը ստուգիչ և փորձնական խմբերում հավաստի  չէր (թեև ստուգիչ խմբի բջիջներում նկատվում է ԴՆԹ-ի պարունակության նվազման միտում), դիտվում է ԴՆԹ-ի պարունակության հավաստի նվազում փորձնական խմբի բջիջների կորիզներում: Երբ պայմանական միավորները փոխարինվում են պլոիդության միավորներով, ապա ստուգիչ պոպուլացիայի շուրջտետրապլոիդ կուլտուրան (3,9±0,2 “c”) դառնում է գերտետրապլոիդ (6,3±0,4) t=5,33, p<0,001: Բջիջների  կորիզների  մակերեսի և պարագծի ցուցանիշները փորձնական խմբում փոխվում են աննշան` ստուգիչ խմբի արդյունքների համեմատությամբ (p<0,1): 

Մեր կողմից ուսումասիրվել է նաև RD բջիջների կորիզակային ակտիվությունը ստուգիչ և փորձնական` թ-ցԱՄՖ-ի ազդեցությամբ խմբերում: Ստացված տվյալները բերված են նկար 2-ում:

Նկար 2-ից երևում է, որ կորիզին ընկնող կորիզակաների քանակը չի փոփոխվում ստուգիչ և փորձնական խմբերում: Ավելին, կորիզակների ընդհանուր քանակը զգալիորեն չի տարբերվում ուսումասիրվող երկու խմբերում կուլտիվացման տարբեր ժամանակահատվածներում: Բջիջների կորիզակների մակերեսի և պարագծի ցուցանիշների փոփոխությունը փորձնական խմբում հավաստի չէ` ստուգիչ խմբի արդյունքների համեմատությամբ, այդ իսկ պատճառով ստացված արդյունքները բերված չեն: 

Եզրակացություն

Այսպիսով, ստացված արդյունքները վկայում են, որ թ-ցԱՄՖ-ն չի ազդում ռաբդոմիոսարկոմայի բջիջների տրանսկրիպցիոնալ ակտիվության վրա: Մեր կողմից չի հայտնաբերվել կորիզակային ցուցանիշների փոփոխություն փորձնական խմբում` ստուգիչ խմբի համեմատությամբ (ցիտոպլազմայում ՌՆԹ-ի հիմնական զանգվածը` 90%-ը համարվում է ռիբոսոմալ և համապատասխանաբար ունի կորիզակային ծագում): Սակայն կուլտիվացման սկզբնական ժամանակահատվածում թ-ցԱՄՖ-ն առաջացնում է միաժամանակ երկու ֆենոմեն` բջիջների պրոլիֆերատիվ ակտիվության հավաստի նվազում և կորիզներում ԴՆԹ-ի պարունակության արտահայտված ավելացում: Նման պատկեր դիտվում է, երբ տեղի է ունենում բջջային ցիկլի արգելափակում G<sub>2</sub> փուլում [2]: Kassel և համահեղինակների [3] տվյալների համաձայն, հարթ մկանային բջիջների պրոլիֆերատիվ ակտիվության նման ընկճումը` ցԱՄՖ-ի ազդեցությամբ, կրում է ցիկլինկախյալ պրոտեինկինազներից անկախ բնույթ:

Այսպիսով, հաշվի առնելով այն, որ բջիջների տրանսկրիպցիոն ակտիվության փոփոխություններ տեղի չեն ունենում, քանի որ կորիզակային ցուցանիշներն անփոփոխ են, կարող ենք ենթադրել, որ թ-ցԱՄՖ-ի կարևոր որակական ներգործությունը ռաբդոմիոսարկոմային բջիջների վրա` վերջիններիս արգելափակումն է G₂ փուլում:  

Գրականության ցանկ

1. Каралян Н.Ю. Сравнительный анализ токсического действия алюминия на различные клеточные культуры человека. Мед. наука Армении; N1, Ереван, 2006, С.111-113.
2. Магакян Ю.А., Каралова Е.М., Каралян З.А., Аброян Л.О., Акопян Л.А., Гаспарян М. Г., Джагацпанян Н.Г., Тер-Погосян З.Р., Семерджян З.Б. Многопараметрическое исследование и классификация (кластер-анализ) трансформированных культур клеток человека различного происхождения. Цитология; 2009, 51, 1, С.18-23. 
3. Kassel K.M., Wyatt T.A., Panettieri R.A. Jr., Toews M.L. Inhibition of human airway smooth muscle cell proliferation by beta 2-adrenergic receptors and cAMP is PKA independent: evidence for EPAC involvement. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol; 2008; 294(1):L131-8.
4. Kumar A.P., Bhaskaran S., Ganapathy M. Akt/cAMP'responsive element binding protein/cyclin D1 network: a novel target for prostate cancer inhibition in transgenic adenocarcinoma of mouse prostate model mediated by nexrutine, a phellodendron amurensen bark extract Clin. Cancer Res.; 2007.- vol. 13, N9, P. 2784-2794.
5. Mao L., Wang J.Q. Glutamate cascade to cAMP response-binding protein phosphorylation in cultured striatal neurons through calcium-coupled group I metabotropic glutamate receptors Mol. Pharmacol.; 2002, Vol. 62, N3, P. 473-484

Հարցեր, պատասխաններ, մեկնաբանություններ