Հեպատիտ C վիրուսի հանդեպ հակամարմիններում 1F7 իդիոտիպի արտահայտվածության փոխկապակցվածությունը վիրուսային ծանրաբեռնվածության և ամինոտրանսֆերազների ակտիվության հետ

Բանալի բառեր. իդիոտոպ, իդիոտիպ, հեպատիտ C, վիրուսային ծանրաբեռնվածություն, ամինոտրանսֆերազներ

Իմունոգլոբուլինների կամ T բջիջների ռեցեպտորների փոփոխական տեղամասերի անտիգենային դետերմինանտները կոչվում են իդիոտոպեր, իսկ այդ իդիոտոպերի ագրեգատը` իդիոտիպ (Id): Առանձին իդիոտոպերի նկատմամբ առաջացած հակամարմինները, որոնք փոխազդում են իմունոգլոբուլինների առանձնահատուկ V տեղամասի հետ, կոչվում են հակաիդիոտիպիկ: 

Id-ը առաջանում են B բջիջների օնտոգենեզի ժամանակ ձևավորվող առաջնային V ռեգիոնում ներկայացվելու միջոցով: Դա կատարվում է գենի վերադասավորման, ձևափոխության և կոմբինացիոն զուգավորման պատահական պրոցեսում: Եթե համապատասխան իդիոտոպը կազմվում է սաղմնային վիճակով կոդավորված փոփոխական (V), տարատեսակության (D) կամ միավորող (J) գենային հաջորդականության մեջ` Id-ը լինում է ընդհանուր և արտահայտված տարբեր սպեցիֆիկության հակամարմիններում (ՀՄ): Դրան հակառակ, եթե իդիոտոպը բնութագրվում է առանձնահատուկ V-ծանր/V-թեթև շղթաների կոմբինացիայով` միավորելով իդիոսինկրատիկ, բնութագրական VD, VJ կամ DJ միացումները, համապատասխան Id-ը առաջանում է միայն անտիգենային սելեկցիայից կամ բջջային տրանսֆորմացիայից հետո: Id-ի այս տիպը սովորաբար լինում է անհատական (պոպուլյացիայի համար ընդհանուր չէ) և սահմանափակված է նույնատիպ սպեցիֆիկության մյուս ՀՄ-ից: Իմունոգլոբուլինների V յուրահատուկ գենի սեգմենտի անտիգենային սելեկցիան նպաստում է անհատական իմունոգլոբուլինների կազմում Id-ի արտահայտվածությանը իմուն կարգավորման պրոցեսում: Ընդհանուր Id-ի ավելացումը արտացոլում է պոպուլյացիայի մեջ գենետիկ, շրջակա միջավայրի կամ այլ կարգավորող հատկանիշների ընդհանրությունը: 

Հեպատիտ C վիրուսն (ՀCՎ) ունի թույլ իմունոգենություն, որով էլ պայմանավորված է դանդաղ և ոչ պրոտեկտիվ բջջային և հումորալ իմուն պատասխանների զարգացումը: Հումորալ պատասխանը իրականանում է սպեցիֆիկ չեզոքացնող ՀՄ-ի (հակա-ՀCՎ) արտադրությամբ, որոնք վարակի վաղ փուլում չեզոքացնում են վիրուսին, սակայն ՀCՎ-ի մուտացիոն փախուստը բերում է նրա պերսիստենցիային և քրոնիկ վարակի առաջացմանը [1]: Այդ ՀՄ-ը միայնակ բավարար չեն լինում կանխելու և վերացնելու ՀCՎ վարակը: Վիրուսից մաքրումը զուգակցվում է վարակի վաղ փուլում չեզոքացնող ՀՄ-ի արագ արտադրության հետ և դրան հակառակ, չեզոքացնող ՀՄ-ի քիչ քանակությունը վաղ փուլում և այդ ՀՄ-ի ուշացած արտադրությունը զուգակցվում է քրոնիկ վարակի հետ: Քրոնիկ վարակված հիվանդների մոտ առկա չեզոքացնող ՀՄ-նեը խաչաձև ռեակտիվ են լինում վիրուսի տարբեր գենոտիպերի նկատմամբ, այսինքն հնարավորություն են ունենում փոխազդելու նմանատիպ անտիգենների հետ [2]: Այդ հակա-ՀCՎ տարբեր սպեցիֆիկության ՀՄ-ում առաջանում է ընդհանուր 1F7 Id–ի արտահայտվածություն` զուգակցված B բջիջների կլոնալ դոմինանտության հետ [3]: 1F7 Id-ը չի սահմանափակվում միայն առանձնահատուկ VH գենով և առաջանում է ՄԻԱՎ, ՀCՎ և կապիկի իմունոդեֆիցիտի վիրուսի դեմ առաջացած ՀՄ-ում [4, 5]:

Սուր ՀCՎ վարակը մոտ 15-30% դեպքերում ինքնուրույն վերանում է, իսկ մնացած դեպքերում քրոնիկ պաթոգենի հետ B1B բջիջների փոխազդեցությունը` բերում է այդ բջիջների կողմից արտադրված հակավիրուսային ընդհանուր, խաչաձև ռեակտիվ 1F7 Id-ի ավելացմանը [6]: Ըստ վերջին ուսումնասիրությունների` անհատները, որոնք մաքրվել են ՀCՎ վարակից, ունեին ուժեղ T բջջային պատասխան, բայց թույլ հակա-ՀCՎ ՀՄ-ի պատասխան համեմատած այն անհատների խմբի հետ, որոնց մոտ զարգացել էր քրոնիկ վարակ [7]: Սակայն դեռ հասկանալի չէ, թե ինչպես է ընդհանուր Id արտահայտող B1 կամ B2 բջիջների կլոնալ դոմինանտության հաստատումը ՀCՎ վարակի վաղ փուլում արգելակում հումորալ իմուն պատասխանի ադապտացիան նոր առաջացող վիրուսի մուտանտների դեմ և նպաստում քրոնիկ ՀCՎ վարակի առաջացմանը, ինչպես նաև լյարդի իմուն միջնորդավորված ախտահարմանը: 

Մեր աշխատանքի նպատակն է` ուսումնասիրել ՀCՎ վարակի ժամանակ ընդհանուր, խաչաձև ռեակտիվ 1F7 Id-ի քանակությունը հակա-ՀCՎ ՀՄ-ում և նրա փոխկապակցվածությունը վիրուսային ծանրաբեռնվածության, շիճուկային ամինոտրանսֆերազների ակտիվության հետ:

Նյութը և մեթոդները

ՀCՎ-ով վարակված 88 անհատների արյան նմուշների հետազոտությունները կատարվել են «Արմենիկում» կլինիկական կենտրոնի գիտահետազոտական լաբորատորիայում, Երևանի պետական բժշկական համալսարանի ինֆեկցիոն հիվանդությունների ամբիոնում և  «Արաբկիր» բժշկական համալիր - Երեխաների և դեռահասների առողջության ինստիտուտի լաբորատորիայում: Հիվանդներն եղել են ազգությամբ հայ` 72 տղամարդ և 13 կին, որոնց տարիքը տատանվում էր 14-72 տարի (միջին տարիքը 38+12,9):

Արյան նմուշնեը վերցվել են մինչև հակավիրուսային բուժումը կամ բուժման ավարտից առնվազն 6 ամիս անց: 

3 հիվանդների որոշ իմունոլոգիական հետազոտության տվյալներ օգտագործվել են արդյունքների վերլուծության ընթացքում, սակայն նրանք դուրս են եկել հետագա հետազոտություննեից: 

85 հիվանդներից ՀCՎ-ի ծանրաբեռնվածության հետազոտություն իրականացվել է 57-ի և գենոտիպի որոշում 45-ի մոտ: 

31 հիվանդներ 6 ամսվա ընթացքում ստացել են հակավիրուսային բուժում, որոնցից 20-ը մաքրվել են ՀCՎ-ից և բժիշկների կողմից գնահատվել են որպես կայուն վիրուսոլոգիական պատասխանողներ: 7 հիվանդ հակավիրուսային բուժմանը չի պատասխանել: 

Հակա-ՀCՎ-ի հայտնաբերումը արյան շիճուկում իրականացվել է հակա-ՀCՎ-ի որոշման երկրորդ կամ երրորդ սերնդի կոմերցիոն հավաքածուներով: ՀCՎ- ի առկայությունը որոշվել է վիրուսի ՌՆԹ-ի հայտնաբերմամբ (որակական հետազոտություն) և գնահատվել է վիրուսի քանակությունը (վիրուսային ծանրաբեռնվածություն): Այդ հետազոտությունները իրականացվել են պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (PCR) մեթոդով Roche ֆիրմայի Cobas Amplicor անալիզատորով: Օգտագործվել են Roche ֆիրմայի Amplicor HCV RNA, HCV Monitor test 2,0 հավաքածուները: Վիրուսային ծանրաբեռնվածությունը որոշող հետազոտության դետեկցիայի շեմքը 500 ՄՄ/մլ է, իսկ որակական հետազոտությանը` 50 ՄՄ/մլ է: Մեթոդի զգայունությունը 99 % է, սպեցիֆիկությունը` 98,6%: 

1F7 Id-ի որոշումը հակա-ՀCՎ ՀՄ-ում իրականցվել է կարծր ֆազային իմունոֆերմենտային մեթոդով` Immulon-2 հավաքածուով (VWR Scientific, Mississauga ON): 

Շիճուկային ալանինամինոտրանսֆերազի (ԱԼՏ), ասպարտատամինոտրանսֆերազի` (ԱՍՏ) որոշումը իրականցվել է ավտոմատ բիոքիմիական անալիզատորով (LISA 500 PLUS, Hycel Diagnostics):

Վիճակագրական հետազոտությունները իրականացվել են պարամետրիկ և ոչ պարամետրիկ դիսպերսիոն մեթոդով, օգտագործելով Graph Pad Prism v 4.01 ծրագիրը: Տվյալներն օգտագործվել են հաշվելու համար միջին արժեքները, ըստ Student-ի թեստի (Pt), զուգավորման t - թեստի (Pp), Wilcoxon–Mann-Whitney և Welchs թեստի (Pw), P‹0.05 տարբերությունները գնահատվել են վիճակագրորեն նշանակալի:

Արդյունքները և դրանց քննարկումը

Մեր կողմից կատարված վերլուծությունները ցույց տվեցին, որ 45 հիվանդներից 17-ը (37,7%) ունեին 3a գենոտիպ, 15-ը (33,3 %)` 1b, 4-ը (8,8 %)` 1a, 4-ը (8,8%)` 2a, 5–ը (11,1%)` 2a/2c (նկ. 1): ՀCՎ-ի տարբեր գենոտիպերի և հակա-ՀCՎ-ում 1F7 Id-ի քանակության միջև որևէ փոխկապակցվածություն չենք հայտնաբերել:

Նկար 1. Հիվանդների բաշխումը ըստ ՀCՎ-ի տարբեր գենոտիպերի

Մեր հետազոտությունների արդյունքները ցույց տվեցին, որ 85 հիվանդներից 10-ի մոտ (12%) հակա-ՀCՎ-ում 1F7 Id չի հայտնաբերվել (օպտիկական խտությունը` OD ցածր է եղել 0,100-ից): Այս հիվանդները մեր կողմից առանձնացվել են որպես 1F7- չպատասխանողներ (NR): 5 հիվանդների մոտ (6%) հակա-ՀCՎ-ում 1F7 Id-ը եղել է թույլ դրական (OD մեծ է եղել 0,100-ից և փոքր 0,200-ից): Սրանց առանձնացրել ենք որպես 1F7- թույլ պատասխանողներ (LR): 16 հիվանդների մոտ (19%) հակա-ՀCՎ-ում 1F7-ը եղել է դրական (OD մեծ է 0,200-ից և փոքր 0,700-ից): Այս հիվանդներն առանձնացվել են որպես 1F7- պատասխանողներ (Gray), իսկ մնացած 54 հիվանդների մոտ (63%) հակա-ՀCՎ-ում 1F7-ը եղել է խիստ դրական, որոնց էլ առանձնացրել ենք որպես 1F7-ուժեղ պատասխանողներ (R) (նկ. 2):

Նկար 2. 1F7 Id-ի քանակության հարաբերակցությունը NR, LR, Gray և R խմբերում

Այսպիսով, պայմանականորեն 1F7 NR, LR, Gray և R չորս տարբեր խմբերի բաժանած հիվանդների մոտ համեմատել ենք, թե ինչպես են այդ խմբերը տարբերվում վիրուսոլոգիական և կենսաքիմիական տվյալներով: 

ՀCՎ վարակված 9 հիվանդներից, որոնց վիրուսային ծանրաբեռնվածությունը ցածր է եղել 600 ՄՄ/ մլ-ից, 7-ը ունեին նաև 1F7-ի ցածր մակարդակ: Հետաքրքիր է, որ նշված 7 հիվանդներից 5-ը եղել են 1F7-բացասական և 2-ը` 1F7-դրական: Մյուս կողմից` 7 վիրուսոլոգիապես չպատասխանողների մեջ միայն մեկն է եղել 1F7-բացասական (նկ. 3): 

Ա		Բ

 Նկար  3. 1F7 իդիոտիպի OD -ի տեղաբաշխումը 600 ՄՄ/մլ-ից ցածր վիրուսային ծանրաբեռնվածությամբ հիվանդների (Ա) և վիրուսոլոգիապես չպատասխանողների (Բ) մոտ

Մենք հետազոտել ենք վիրուսային ծանրաբեռնվածությունը 1F7 NR, Gray և R խմբերում: Ինչպես երևում է նկար 4-ից` վիրուսային ծանրաբեռնվածությունը նշանակալից ցածր է 1F7 չպատասխանողների մոտ, համեմատած` 1F7 պատասխանողների և 1F7 ուժեղ պատասխանողների հետ, իսկ 1F7- պատասխանողների մոտ նշանակալից ցածր է 1F7 ուժեղ պատասխանողների համեմատ (նկ. 4): 

Նկար 4. Վիրուսային ծանրաբեռնվածությունը 1F7 NR, 1F7 Gray և 1F7 R խմբերում

Նշված խմբերում շիճուկային ԱԼՏ-ի և ԱՍՏ-ի մակարդակների վերաբերյալ ստացել ենք հետևյալ տվյալները` ԱԼՏ-ի միջին մակարդակը 1F7 NR խմբում նշանակալից ցածր է 1F7 ԼR և R խմբերի համեմատ (77,4±21 Մ/լ,1 և 59,1±12,5 Մ/լ): 1F7 ԼR և Gray խմբերում ԱԼՏ-ի միջին մակարդակների տարբերությունը նշանակալից չէ 1F7 R խմբի համեմատ (48,6+3,6 Մ/լ ), սակայն ԱԼՏ-ի մակարդակը նշանակալից տարբեր է 1F7 ԼR և Gray խմբերում ( Pt ‹ 0,0001 ) (նկ. 5): 

Մենք ստացել ենք նմանատիպ տվյալներ ԱՍՏ-ի մակարդակի համար: ԱՍՏ-ի մակարդակը բարձր է 1F7 ԼR խմբում (94,4±28,9 Մ/լ, Pw= 0,04), Gray խմբում (81,7±15,1 Մ/լ , Pw= 0,05) և R խմբում (81,6±8,2 Մ/լ, Pw=0,02) համեմատած` 1F7 NR-ի հետ (54,1±18,0 Մ/լ), տարբերություն չկար 1F7 ԼR, Gray և 1F7 R խմբերում (նկ. 5): 

Նկար 5. Շիճուկային ամինոտրանսֆերազների մակարդակների տարբերությունը 1F7 Id բացասական (NR), ցածր (LR), դրական (Gray) և բարձր ցուցանիշով (R) խմբերում: 

Նախկինում կատարված մեր հետազոտություններում մենք համեմատել ենք աշխարհագրական և էթիկական տեսակետից իրարից տարբեր երկու խմբերում ՀCՎ-ից ինքնամաքրված սուբյեկտների և քրոնիկ վարակվածների մոտ հակա-ՀCՎ ՀՄ-ի ցուցանիշները և 1F7 Id-ի արտահայտվածությունը այդ ՀՄ-ում: 

Հայ և կանադացի ՀCՎ դրական անհատների արյան նմուշներում մենք ստացել ենք հետևյալ արդյունքները: Հայկական արյան նմուշներում հակա-ՀCՎ-ի OD եղել է 0,47 – 3,5: 54 կանադական նմուշներում հակա-ՀCՎ OD եղել է 0,9 – 2,6: Երկու նմուշներում, որոնք ինքնամաքրվել էին ավելի քան 20 տարի առաջ, հակա-ՀCՎ core ՀՄ- ը եղել են բացասական, բայց ՀCՎ-ի առկայությունը հաստատվել էր հակա-ՀCՎ NS 3, 4 և 5 ՀՄ- ի հայտնաբերումով: 

Որոշելու համար, թե արդյոք կա որևէ զուգակցում հակա-ՀCՎ-ում 1F7 Id-ի առկայության և հիվանդության զարգացման ելքերի միջև, մենք համեմատել ենք հայկական և կանադական խմբերում այդ ցուցանիշները ինքնամաքրվածների և քրոնիկ ՀCՎ վարակվածների մոտ:

ՌՆԹ բացասական արդյունքով 5 կանադական և 8 հայկական նմուշներ եղել են ինքնամաքրվածներ: Կանադացի ինքնամաքրվածների մոտ հակա-ՀCՎ-ի միջին OD նշանակալի ցածր էր համեմատած քրոնիկ ՀCՎ վարակվածների հետ (0,73±0,75 ի դեմս 1,90± 0,52, p‹.01) և շատ աննշան տարբերություն է եղել հայկական խմբում (2,24±0,88 ի դեմս 2,85±0,66 p‹. 01):

1F7 Id-ի միջին քանակությունը հակա-ՀCՎ ՀՄ-ում ինքնամաքրվածների մոտ ցածր է եղել քրոնիկ վարակվածների համեմատ (կանադացիների մոտ` 0,15±0,29 ի դեմս 1,71±1,05, p‹. 001; հայերի մոտ 0,76±1,12 ի դեմս 1,60±1,08, p ‹. 05): Այսպիսով, երկու խմբերում էլ ինքնամաքրվածների և քրոնիկ վարակվածների հակա-ՀCՎ -ում 1F7 Id-ի քանակության նշանակալի տարբերություններ կան: Եթե սուր ՀCՎ վարակը ավարտվում է ինքնամաքրումով, ապա 1F7 Id-ի առկայությունը աստիճանաբար վերանում է: Կանադական, բայց ոչ հայկական խմբում ինքնամաքրվածները քրոնիկ վարակվածների համեմատ ունեն հակա-ՀCՎ - ի ցածր միջին մակարդակ: Սա հավանաբար կապված է այն բանի հետ, որ կանադական ինքնամաքրվածների հետմաքրման ժամանակը ավելի երկար է, քանի որ կանադացի ինքնամաքրվածներից հինգից երեքի մոտ ՀCՎ ՌՆԹ բացասական արդյունքից անցել էր ավելի քան 20 տարի, մինչդեռ ութ հայ ինքնամաքրվածները ունեն հետմաքրման հարաբերականորեն ավելի կարճ ժամանակ: 

Այսպիսով, մեր կատարած հետազոտությունների արդյուքները վկայում են, որ ՀCՎ-ով վարակվածների շիճուկում ընդհանուր, խաչաձև ռեակտիվ 1F7 Id-ի մակարդակը ուղղակի հարաբերակցվում է շիճուկային ամինոտրանսֆերազների ակտիվության և հակադարձ հարաբերակցվում է վիրուսային ծանրաբեռնվածության հետ:

Поступила 23.02.11

Գրականություն

1. Michael D. Grant. Antibody convergence along a common idiotypic axis in immunodeficiency virus and hepatitis C virus infections. J. Med. Virol., 2002; 66; 13-21 
2. Shimizu Y.K., Hijikata M., Iwamoto A., Alter H.J., Purcell R.H., Yoshikura H. Neutralizing antibodies against hepatitis C virus and the emergence of neutralization escape mutant viruses. J. Virol., 1994; 68; 1494-1500.
3. Tigran K. Davtyan, Marine J. Hovsepyan, Levon M. Mkhitaryan, Gagik S. Hakobyan, Aiden Brazil, Lisa Barrett, Geri Hirsch, Kevork M. Peltekyan and Michael D. Grant The 1F7 idiotype is selectively expressed od CD5+ B cells and elevated in chronic hepatitis C virus infection. Immunology and Cell Biology; 2009, 87; 457-463. 
4. Muller S., Wang H., Silverman G.J., Bramlet G., Haigwood N., Kohler H. B-cell abnormalities in AIDS. Stable and clonally-restricted antibody response in HIV-1 infection. Scand. J. Immunol., 1993; 38; 327-334.
5. Grant M., Whaley M., Mayne A., Hoffmann G., Ansari A.A. Similar abnormalities of idiotype and immunoglobulin light chain expression and cell-mediated cytotoxitity in HIV infected humans and simian immunodeficiency virus SIV-infected rhesus macaques. Immunol. Cell. Biol., 1996; 174; 38-44.
6. Bartosch B., Bukh J., Meunier J.C. et al. In vitro assay for neutralizing antibody to hepatitis C virus, evidence for broadly conserved neutralization epitops. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003; 100; 14199-204. 
7. Kaplan D.E., Sugimoto K., Valiga M.E., Ikeda F., Aytaman A. et al. Discordant role of CD4 T cell response relative to neutralizing anyibody and CD8 T cell responses in acute hepatitis C. Gastroenterology, 2007; 132; 654-666.

Հարցեր, պատասխաններ, մեկնաբանություններ